CRISPR/Cas9体内筛选揭示TFDP1与E2F4在造血功能中的关键作用

作者与发表信息
本研究由Ngoc Tung Tran（现任职于印第安纳大学医学院）、Robin Graf（柏林夏里特医学院）、Klaus Rajewsky和Van Trung Chu（均来自德国柏林Max-Delbrück分子医学中心）等共同完成，于2024年7月23日发表于《Leukemia》（2024年38卷，2003-2015页）。

学术背景

研究领域与动机
造血作用（Hematopoiesis）是由造血干细胞和祖细胞（HSPCs）驱动的持续血液生成过程，其增殖与分化受复杂转录网络调控。尽管已知部分转录因子（如GATA家族、锌指蛋白ZFP等）参与调控，但HSPC移植后造血重建的分子机制尚未完全阐明。本研究旨在通过CRISPR/Cas9体内筛选，鉴定调控HSPC增殖和分化的关键转录因子。

科学问题
HSPC移植后如何通过转录网络实现高效造血重建？哪些转录因子是这一过程的核心调控者？

研究目标
开发基于CRISPR/Cas9的体内遗传筛选系统，鉴定HSPC增殖和移植后造血功能必需的关键转录因子，并解析其分子机制。

研究流程与方法

1. 体外CRISPR/Cas9筛选

• 研究对象：从小鼠骨髓中分离Lin-Sca1+cKit+ HSPCs，混合Cas9-GFP转基因与野生型细胞（1:1比例）。
  
• 实验设计：针对32个候选基因（包括29个ZFP、TFDP家族成员及其他高表达转录因子）设计3个sgRNA/基因，以靶向rosa26的sgRNA为阴性对照。
  
• 方法：通过慢病毒转导sgRNA，感染效率控制在20-60%。培养7天后，通过流式细胞术分析GFP+（Cas9+）细胞的存活/增殖比例（Survival/Proliferation Score）。
  
• 关键发现：TFDP1和ZFP114的敲除导致HSPCs存活率显著降低（Sur/Pro Score < -1），与已知必需基因LMO2和UHRF1效果相当。
  

2. 体内CRISPR/Cas9筛选

• 动物模型：将sgRNA感染的Cas9+/Cas9- HSPCs（3:2比例）移植至亚致死剂量照射的Rag2-/-γc-/-免疫缺陷小鼠，覆盖500 HSPCs/sgRNA。
  
• 分析时间点：移植8周后，通过深度测序检测骨髓、脾脏中sgRNA的丰度变化。
  
• 验证结果：TFDP1敲除导致所有造血谱系（HSPCs、粒细胞、B/T细胞）的sgRNA丰度显著下降，而ZFP114无此效应，表明TFDP1是移植后造血的关键调控因子。
  

3. TFDP1与E2F4的功能验证

• 相互作用验证：通过免疫共沉淀（Co-IP）证实TFDP1与E2F4在HSPCs中直接结合。
  
• 细胞表型：
  
  • 增殖实验：CellTrace标记显示TFDP1或E2F4敲除的HSPCs分裂停滞（第3天停滞于1-2次分裂，对照组达5次）。
    
  • 凋亡检测：Annexin V和Caspase-3染色未发现凋亡增加，表明表型源于增殖抑制。
    
• 转录组分析：RNA-seq显示TFDP1敲除导致细胞周期相关基因（如CDK1）下调，其中50%为TFDP1/E2F4直接靶标（通过ChIP-seq数据交叉验证）。
  

4. 数据整合与机制解析

• Meta分析：整合公共数据集（如小鼠胚胎干细胞E2F4 ChIP-seq），发现TFDP1/E2F4通过保守结合位点激活细胞周期基因。
  
• 特异性分析：E2F4在HSPCs中为促增殖因子，而在B细胞中作用较弱，提示细胞类型依赖性功能。
  

主要结果与逻辑关联

1. 体外筛选：初步锁定TFDP1为HSPC增殖必需因子。
   
2. 体内验证：移植模型证实TFDP1缺失损害多谱系造血重建。
   
3. 分子机制：TFDP1与E2F4形成复合物，直接激活细胞周期基因（如CDK1），而非通过凋亡途径。
   
4. 保守性：TFDP1/E2F4结合位点在人与小鼠中高度保守，提示跨物种功能相似性。
   

结论与意义

科学价值
- 首次通过CRISPR/Cas9体内筛选揭示TFDP1/E2F4是HSPC增殖的核心转录激活复合物。
- 提出“TFDP1-E2F4-细胞周期基因”轴是造血稳态和移植后重建的关键调控通路。

应用潜力
- 为造血干细胞移植（HSCT）效率提升提供新靶点。
- 为血液系统增殖性疾病（如白血病）的治疗策略开发提供理论基础。

研究亮点

1. 方法创新：建立高效体内CRISPR筛选系统，结合Cas9转基因小鼠与深度测序，实现单sgRNA/细胞的精准分析。
   
2. 发现新颖性：揭示E2F4在HSPCs中作为转录激活因子的非经典功能（传统认为E2F4是抑制因子）。
   
3. 跨学科整合：综合遗传学、转录组学及表观遗传学数据，全面解析TFDP1/E2F4的调控网络。
   

补充价值
- 公开数据集（RNA-seq、ChIP-seq）为后续研究提供资源。
- 开发的CRISPRgold sgRNA设计软件可用于其他遗传筛选研究。

（注：全文基于原文内容提炼，专业术语如“HSPCs”首次出现时标注英文，后续使用中文简称“造血干细胞/祖细胞”。）