本研究的通讯作者为美国华盛顿大学物理系的Jens H. Gundlach教授，合作团队包括来自华盛顿大学和阿拉巴马大学伯明翰分校微生物学系的研究人员。该研究于2012年4月发表在《Nature Biotechnology》第30卷第4期。

【学术背景】
该研究属于纳米孔测序技术领域，旨在解决两个长期存在的技术瓶颈：单核苷酸分辨率与DNA易位控制。传统纳米孔测序面临DNA穿膜速度过快（>1核苷酸/微秒）和电流信号分辨率不足的挑战。研究团队前期已开发出由分枝杆菌耻垢分枝杆菌孔蛋白A（Mycobacterium smegmatis porin A, MspA）改造的突变体纳米孔，其1.2 nm宽、0.6 nm长的狭窄区（constriction）能显著提升核苷酸区分能力。本研究通过结合phi29 DNA聚合酶（phi29 DNA polymerase, phi29 Dnap）的分子马达功能，首次实现了对未修饰DNA链的单核苷酸分辨率实时检测。

【研究流程】
1. 蛋白质与DNA制备
- 突变体M2-NNN MspA从耻垢分枝杆菌中纯化，DNA模板（42-53核苷酸可读区）经退火处理与引物及阻断寡核苷酸（blocking oligomer）形成复合物。阻断寡核苷酸设计含7个无碱基位点（abasic sites）作为电流标记物。

1. 纳米孔实验系统构建

   • 在水平20 µm孔径的Teflon膜上形成脂质双层，两侧腔室填充0.3 M KCl缓冲液（pH 8.0）。通过Axopatch 200B膜片钳放大器施加+180 mV跨膜电压，单个MspA孔插入后加入phi29 Dnap（0.75 µM）和dNTPs（100 µM each）启动合成反应。
     

2. 电流信号采集与分析

   • 电流信号经4阶贝塞尔滤波器（100 kHz）预处理后以500 kHz采样率数字化。开发了基于MATLAB的自定义算法：
     
     • 阶跃检测：采用梯度阈值法识别电流层级（levels）
       
     • 数据对齐：使用Needleman-Wunsch算法对多事件电流层级进行序列比对
       
     • 噪声过滤：Savitzky-Golay滤波器（2阶）与5点滑动窗口降采样
       

3. 关键实验设计

   • 同聚物模板验证：设计含A3/G3/C5/T3重复序列的”block homopolymer”模板，验证核苷酸特异性电流特征（如dT3电流降至开放孔的20%）。
     
   • 单核苷酸替换实验：在”CAT”重复序列中插入单个dG，观察到连续4个电流层级偏移（Δ达40 pA）。
     
   • 饥饿实验：降低dCTP浓度诱导phi29 Dnap暂停，测定其活性位点与纳米孔收缩区的距离为14-15核苷酸。
     

【主要结果】
1. 电流层级与序列对应关系
- 合成阶段电流层级中位数持续时间28 ms，不同核苷酸组合电流差异达40 pA。dA3/dG3/dC4/dT3对应的相对电流分别为0.⁴⁰⁄₀.³⁰⁄₀.³⁷⁄₀.20（I/Io）。
- 异源序列实验中，90%的电流层级按正确顺序被检测（σ% Io），证明MspA收缩区可稳定捕获约4个核苷酸的序列信息。

1. 马达控制性能

   • phi29 Dnap使DNA易位速度降至2.5-40 nt/s，较电场驱动（>1 nt/µs）慢5个数量级。合成阶段速度（τ=40 ms）快于阻断寡核苷酸解链阶段（τ=100 ms）。
     
   • 观察到”toggle”模式（出现概率15%），对应聚合酶3′-5′外切酶校正功能的单核苷酸回退。
     

2. 冗余读取验证

   • 同一DNA区域在解链（5′→3′）和合成（3′→5′）阶段产生镜像对称的电流层级，通过abasic位点标记（0.6 Io）实现序列定位。
     

【结论与价值】
该研究首次将生物纳米孔的单核苷酸分辨率与分子马达的精确控制相结合，建立了纳米孔测序的核心技术框架。其科学价值体现在：
1. 阐明MspA收缩区对4核苷酸窗口的电流调制机制
2. 验证phi29 Dnap作为纳米孔测序理想马达的可行性
3. 为后续商业开发提供关键参数（如信噪比、层级持续时间）

【研究亮点】
1. 方法创新：
- 改造MspA孔蛋白（ vestibule区引入24个正电荷）提升DNA捕获率
- 首创”阻断寡核苷酸-phi29 Dnap”复合体控制策略

1. 技术突破：

   • 单核苷酸替换实验证明系统可检测SNP（单核苷酸多态性）
     
   • 电流层级标准差% Io，为当时最高重现性记录
     

2. 前瞻性建议：

   • 提出需建立4核苷酸组合电流特征库以实现序列反卷积
     
   • 指出均聚物长度判定是未来算法开发难点
     

【其他发现】
实验发现电流特征不仅取决于核苷酸类型，还受二级结构、核苷酸-孔道相互作用等因素影响。例如”ACGA”序列虽仅含侧翼腺嘌呤，仍产生高电流信号，提示空间位阻效应的潜在贡献。该现象为后续纳米孔表观遗传检测研究提供了新思路。