学术报告

一、研究作者与机构及发表信息

本文的主要作者包括Ming Jiang、Song Yan、Weichao Ren、Nannan Xing、Hongyuan Li、Meiqi Zhang、Meiqi Liu、Xiubo Liu和Wei Ma（通讯作者），他们分别来自中国黑龙江中医药大学药学院、齐齐哈尔医学院科学技术系、东北林业大学以及佳木斯中医药大学。该研究发表在Electronic Journal of Biotechnology期刊2023年第62期，文章标题为“Genetic diversity of the Chinese medicinal plant Astragali Radix based on transcriptome-derived SSR markers”，并于2022年12月26日在线发表。

二、研究背景与研究目的

本研究隶属中药材基因多样性与分子标记领域。主旨是分析一种重要的传统中药材——黄芪（Astragali Radix）的遗传多样性及其分子育种应用。黄芪已有两千多年的药用历史，在中药中被视为一种补气药，具有重要的药用和营养价值，如调节免疫、抗病毒、护肝、抗肿瘤等，但其不同种质资源在药用成分上的机制尚未明确，且现有针对黄芪的SSR（Simple Sequence Repeat，简单重复序列）分子标记资源匮乏。SSR标记技术因其高多态性、共显性和稳定性，已被广泛用于遗传多样性研究和分子育种。然而，黄芪的分子信息匮乏一直限制着其品种鉴定与遗传改良。因此，本研究目的在于通过转录组测序开发黄芪的SSR分子标记，分析其遗传多样性，为后续的基因功能研究、遗传图谱构建和分子标记辅助育种提供基础数据。

三、研究方法与流程

本研究共分为六个主要步骤，具体流程如下：

1. 植物材料的采集与RNA/DNA提取

研究选取了Astragalus mongholicus和Astragalus membranaceus两个品种，它们分别为《中国药典》中记载的两种药用黄芪资源。植物样本的来源包含甘肃、陕西、黑龙江等8个自然种群，共60种样本（如表格显示）。在黄芪播种120天后采集整株新鲜样本，快速液氮冷冻并储存于-80°C冰箱中提取RNA，以进行转录组测序。同时，用从新鲜叶片中提取的DNA用于SSR标记开发。

2. cDNA文库的构建与高通量序列测序

借助Illumina HiSeq™ 2000平台进行测序，获得了99.6百万条原始数据，通过Trinity软件对高质量序列进行de novo组装，得到296,618条unigene（即非冗余转录序列），平均长度为1,459 bp。序列质量管理步骤包括去空载读数、低质量读数和含接头读数。

3. SSR位点检测与注释分析

利用MISA软件对unigene序列进行SSR位点检测，共鉴定出56,097个含SSR位点的unigene，找到71,207个SSR位点，平均每4.34 kb的unigene序列中包含一个SSR。这些SSR位点被细分为单核苷酸、双核苷酸、三核苷酸等六类重复类型，同时记录了各类型的特定重复样式（如AG/CT、AAT/ATT等）。

注释方面，这些含SSR的unigene被比对到GO、KEGG和COG等公共数据库以确定其功能分类。大约46.7%的unigene与GO数据库关联，29.8%与KEGG数据库关联，15.8%与COG数据库关联，并按其生物学过程（如代谢过程、细胞过程等）、分子功能（如结合活性、催化活性）和细胞成分（如细胞解剖实体、细胞内成分）等进行进一步分类。KEGG富集分析显示碳代谢信号通路和植物激素信号转导是最丰富的类别。

4. SSR引物开发与多样性扩增

在开发的200对SSR引物中，随机选择50对进行进一步验证，最终有23对成功扩增有效片段（46%的成功率）。10个引物对扩增出单一条带，13个引物对扩增出多条带，这主要与黄芪基因组重复特性相关。

5. 遗传多样性分析

研究通过选定的23对引物对60种黄芪样本的遗传多样性进行了系统分析。利用遗传相似性矩阵进行UPGMA（加权平均法）聚类分析，绘制系统树，并研究了样本间的遗传关系。结果显示，样本的遗传相似性系数范围为0.2692至0.8077，平均为0.5742。

四、主要研究结果

1. 高通量测序与SSR位点解析
   本研究通过转录组测序获得了99.6百万原始数据，并成功组装出296,618条unigene，其中56,097条unigene含有SSR位点，标记间隔约为4.34 kb。最常见的单核苷酸重复为A/T（占39.78%），双核苷酸重复为AG/CT（占19.14%），三核苷酸重复为AAT/ATT（占4.6%）。

2. 引物设计和验证
   成功开发出23个功能性SSR标记，其中10个引物扩增出单条片段，可直接用于分子标记和遗传分析。

3. 遗传多样性与系统发育分析
   样本间的遗传相似性较高，但不同地域资源并未形成完全一致的聚类组，部分资源之间无明显地理隔离，这可能反映了种子随意传播和种植缺乏标准育种的现状。

4. 功能标记的发现
   本研究还发现了8个与黄酮类化合物生物合成相关的功能性SSR标记，如与花青素转移酶、查尔酮异构酶相关的基因。这为黄芪活性成分的功能基因研究提供了参考依据。

五、研究结论与意义

本研究成功开发了71,207个EST-SSR位点和23个有效扩增引物，为黄芪的遗传多样性分析提供了高效的分子工具。这些结果不仅为黄芪的基因组学研究及育种提供了重要数据支持，且可推广应用于其他药用植物。EST-SSR标记的高效性和低成本性使其在基因挖掘、功能基因识别、种质资源保护和分子标记育种等方面具有重要意义。本研究进一步丰富了中药黄芪领域的遗传资源，为探索其药用成分差异性及品种改良奠定了科学基础。

六、研究亮点

1. 开发了大规模、高效的EST-SSR分子标记，为基因作图和多样性分析提供了重要工具。
2. 新发现了与黄酮类生成相关的功能性标记，为活性成分遗传机制的研究指明了方向。
3. 提供了对60种黄芪资源的全面遗传多样性评估，揭示了地域分布的遗传关系。

七、补充内容

本研究受到了多项基金资助，包括国家自然科学基金（82173927）、地方高校改革发展项目（ZYRCB2021008）等支持。此外，该研究明确声明无任何利益冲突。