本研究由Zheng Luo、Shu-Jiao Zhang、Jing-Yi Tang、Yuanyuan Deng、Yi Kang、Xing-Hua Zhang、Hong-Mei Lu、Yao-Xian Wang、Wei-Jing Liu和Yu Ma等人共同完成。第一作者Zheng Luo来自北京中医药大学东方医院肾病科，通讯作者Yao-Xian Wang来自河南中医药大学，Wei-Jing Liu来自北京中医药大学东直门医院及中医内科学教育部重点实验室，Yu Ma来自北京中医药大学东方医院肾病科。该研究于2025年9月24日发表于《Frontiers in Pharmacology》期刊，题为“Integrating network analysis and experimental validation to reveal the ferroptosis-associated mechanism of acteoside in the treatment of diabetic nephropathy”。

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最严重的微血管并发症之一，约有30%至40%的糖尿病患者会受累，并且已成为全球终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）的首要病因。DN的临床特征主要表现为持续性白蛋白尿和肾小球滤过率进行性下降，病理上以肾小球基底膜增厚、系膜扩张和肾小管间质纤维化为特征。尽管目前临床上使用肾素-血管紧张素系统抑制剂和钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂能够在一定程度上延缓DN进展，但患者仍然存在较高的肾功能衰退和心血管事件残余风险，因此亟需开发针对新的致病通路的治疗药物。近年来，铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖性、由脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡方式，被越来越多地证实参与DN的发病过程。高糖环境诱导的氧化应激和铁代谢紊乱使肾小管细胞对铁死亡损伤更加敏感，而糖尿病肾脏中谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达下调进一步支持了这一机制。毛蕊花糖苷（acteoside，ACT）是从地黄等药用植物中提取的天然苯乙醇苷类化合物，既往研究已证实其具有抗氧化、抗炎和抗纤维化作用，并能改善链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的DN小鼠的肾功能和肾间质纤维化，但ACT是否通过调控铁死亡来减轻DN尚不清楚。因此，本研究旨在通过网络药理学预测、动物实验验证和分子对接相结合的策略，系统揭示ACT通过靶向铁死亡改善DN的作用及其分子机制。

研究首先采用网络药理学方法，利用BATMAN-TCM、DrugBank、HERB和SwissTargetPrediction四个数据库预测ACT的潜在作用靶点，共获得390个靶点；同时从DisGeNET、SymMap和TTD数据库中收集DN相关治疗靶点，共获得1189个靶点。通过Venn图取交集后，得到42个ACT治疗DN的潜在共有靶点。随后将这些靶点导入STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，并利用Cytoscape软件中的CytoHubba插件以MCC算法筛选出前15个核心靶点，包括MMP9、BCL2、ICAM1、CXCL12、MMP2和PPARG等。进一步通过基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析发现，这些靶点主要富集于氧化应激反应、脂质代谢和AGE-RAGE信号通路等与铁死亡密切相关的生物学过程和信号通路。

为了验证网络药理学的预测结果，研究者建立了STZ诱导的C57BL/6J小鼠DN模型。50只健康雄性小鼠随机分为正常对照组（NC组）和模型组，模型组小鼠接受最多三次腹腔注射新鲜配制的STZ（45 mg/kg/天），空腹血糖连续三天≥16.7 mmol/L视为造模成功。造模成功后，将DN小鼠随机分为DN组、ACT低剂量组（ACT-L，40 mg/kg/天）和ACT高剂量组（ACT-H，80 mg/kg/天），连续灌胃给药12周。实验期间每4周记录体重和血糖，第12周收集24小时尿液并检测24小时尿总蛋白（24-h UTP）、血肌酐（serum creatinine，SCr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。实验结束后取肾组织进行H&E、Masson和PASM染色以评估肾脏病理损伤，并通过Western blot检测肾损伤分子-1（KIM-1）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）的表达水平。结果显示，与NC组相比，DN组小鼠肾脏指数、血糖、24-h UTP、SCr和BUN均显著升高；ACT-H和ACT-L干预12周后，24-h UTP、SCr和BUN均较DN组显著降低，而血糖水平无统计学差异。肾脏病理染色显示，DN组出现肾小管管腔扩张、上皮细胞空泡变性、胶原纤维沉积和肾小球基底膜增厚，而ACT治疗可显著减轻这些病理改变。此外，ACT可显著逆转DN小鼠肾组织中KIM-1和NGAL蛋白的升高，提示ACT能够减轻肾小管损伤。

基于网络药理学提示ACT的治疗作用与氧化应激调控密切相关，研究进一步系统评估了ACT对线粒体功能和氧化应激的影响。通过钙黄绿素荧光染色检测线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）开放程度，结果显示DN小鼠mPTP过度开放，而ACT可显著抑制mPTP开放；利用JC-1染料评估线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP），发现DN组红/绿荧光比值显著降低，ACT-H可逆转这一下降趋势；线粒体形态分析显示DN组线粒体碎片化明显，ACT治疗可恢复线粒体密度和结构完整性。同时，研究检测了AGEs/RAGE信号通路和多种氧化应激标志物。结果显示，DN小鼠血清AGEs水平升高、肾组织RAGE表达上调，而ACT-H可显著降低AGEs并下调RAGE表达。此外，DN小鼠血清脂质过氧化物（LPO）和丙二醛（MDA）水平显著升高，超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量明显降低，而ACT-H可逆转上述变化。流式细胞术检测显示DN组肾组织活性氧（reactive oxygen species，ROS）荧光强度显著增加，ACT-H可显著降低ROS水平。这些结果表明ACT可通过抑制ROS和脂质过氧化、增强抗氧化防御以及抑制AGEs/RAGE信号通路来减轻氧化应激。

鉴于线粒体稳态失衡和氧化应激是触发铁死亡的关键因素，研究进一步检测了铁死亡相关指标。结果显示，DN小鼠血清和肾组织铁浓度均显著升高，ACT治疗可显著降低铁水平；流式细胞术检测也证实ACT可降低细胞内铁荧光强度。Western blot检测铁死亡核心调控分子GPX4和长链脂酰辅酶A合成酶4（ACSL4）的表达发现，DN组GPX4下调而ACSL4上调，ACT可恢复GPX4表达并抑制ACSL4表达，表明ACT能够通过减少铁超载和调控铁死亡关键分子来抑制DN中的铁死亡。研究还深入探讨了Keap1/Nrf2/HO-1信号轴的作用。RT-qPCR、Western blot和免疫荧光结果显示，DN小鼠肾组织中Keap1蛋白表达上调，而Nrf2和HO-1蛋白及mRNA水平受到抑制；ACT干预可下调Keap1、促进Nrf2核转位并上调HO-1表达，表明ACT通过抑制Keap1介导的Nrf2降解并增强HO-1驱动的抗氧化防御来减轻DN中的铁死亡。最后，分子对接分析显示ACT与ACSL4、GPX4、RAGE、HO-1、Keap1和Nrf2的结合能分别为−9.8、−8.0、−8.4、−9.2、−7.6和−7.0 kcal/mol，均低于−5 kcal/mol，表明ACT与这些关键靶点之间具有很强的结合亲和力。

本研究通过整合网络药理学、体内实验验证和分子对接，首次证明ACT通过抑制AGEs/RAGE信号通路和激活Keap1/Nrf2/HO-1轴来减轻DN中的氧化应激和铁死亡，从而发挥肾脏保护作用。ACT不仅能够改善肾功能和减轻肾脏病理损伤，还能恢复线粒体稳态、抑制铁超载和脂质过氧化，并调控GPX4和ACSL4等铁死亡关键分子。该研究为ACT作为DN新型治疗候选药物提供了临床前证据，同时也为靶向铁死亡和氧化还原平衡开发DN干预策略提供了新的思路。研究亮点在于首次阐明了ACT通过铁死亡相关机制改善DN，并揭示了AGEs/RAGE与Keap1/Nrf2/HO-1通路之间在铁死亡调控中的协同作用。然而，该研究仍存在一定局限性，例如分子对接结果属于预测性质，尚需通过表面等离子共振或等温滴定量热法等实验进一步验证结合亲和力和特异性；此外，剂量效应评价仍需更系统的药效学分析以确定最佳治疗窗口和指导临床转化。