作者Fei Xie, Yumeng Hao, Yu Liu等来自多个研究机构，其研究成果于2024年2月21日发表在 Journal of Medicinal Chemistry 上，文章标题为“From Synergy to Monotherapy: Discovery of Novel 2,4,6-Trisubstituted Triazine Hydrazone Derivatives with Potent Antifungal Potency in Vitro and in Vivo”。

研究背景

侵袭性真菌感染（invasive fungal infections，IFIs）是严重的全球公共卫生问题，尤其近年来在重症新冠住院患者中病例大幅增加。目前，IFIs每年导致150-200万例死亡，主要由念珠菌（Candida）、隐球菌（Cryptococcus）以及曲霉菌（Aspergillus）等真菌引起。现有抗真菌药物主要包括氮杂类（azoles，如氟康唑）、棘白菌素类（echinocandins，如米卡芬净）、两性霉素B（amphotericin B）和氟胞嘧啶（flucytosine）。然而，这些药物存在耐药菌株增多、与其他药物作用相互干扰以及毒副作用等问题，严重限制了治疗效果。因此，研发具有新骨架的新型抗真菌药物成为亟待解决的课题。

三嗪类（triazine）化合物作为一类重要的杂环，因其多样的药理学性质和便利的合成模板成为药物设计中的优选结构。而腙类（hydrazone）衍生物则因其共轭结构（−NH−N=CH−）显示出一定的抗真菌活性。然而，以往研究中，1,3,5-三嗪和腙的结合尚未表现出显著的抗真菌特性。有鉴于此，该研究基于已有的命中分子（hit compound），通过结构优化研发了新型2,4,6-三取代三嗪腙化合物，旨在对抗耐药性真菌，特别是氟康唑抗性菌株，并探索新的抗真菌作用机制。

研究流程和方法

分子设计与合成

研究人员以氟康唑和先导化合物（hit compound “Enoblock”）为起点，提出了全新的三嗪腙化学骨架设计策略： 1. 分子简化：通过去除原有的PEG-酰胺链，引入腙基连接三嗪与苯环。 2. 修饰端基：对苯环的不同取代基进行系统化优化，筛选出具有潜在抗真菌活性的结构。 3. 化合物合成：采用两步核苷亲核取代法以及缩合反应合成了32个靶向化合物（编号为4-35）。

体外活性评价

所有化合物遵循临床与实验室标准协会（CLSI）的M27-A3和M60方法，评估对氟康唑耐药的两株念珠菌菌株（C. albicans 901和904）的抗真菌活性。通过Checkerboard微量稀释法进一步分析化合物与氟康唑的协同抗真菌效果，并计算FICI值（协同效应FICI < 0.5）。

构效关系研究（SAR）

重点围绕靶向化合物的苯环取代基和三嗪侧臂的不同修饰，探索其对抗真菌活性的影响。

体内外机制研究

通过GC-MS分析三嗪腙化合物对菌膜内甾醇成分的影响；并借助共焦激光显微镜、RT-PCR以及透射电镜（TEM）研究其对菌细胞壁和超微结构的作用。

毒性与药代动力学测试

通过CCK-8试验和溶血实验评估化合物的细胞毒性与溶血性。同时，进行动物肝微粒体实验评估化合物的代谢稳定性，并在啮齿动物体内进行药代动力学研究。

主要结果

抗真菌活性与协同效应

1. 协同抗真菌作用：部分羟基（OH）取代的三嗪腙（如20, 26-29号化合物）展现了与氟康唑显著的协同作用（FICI范围 0.16-0.38）。
2. 单药活性提高：其中2-OH-5NO2取代的28号化合物对氟康唑耐药的C. albicans显示了中等的抑菌活性（MIC = 1.0-4.0 μg/ml），“28”在多种致病真菌中表现了广谱活性（MIC = 0.5-16.0 μg/ml）。

构效关系（SAR）

1. 苯环上的羟基（特别是在邻位的2-OH）是实现药物活性的关键。当额外引入强吸电子基如硝基（NO2）时，活性显著增强。
2. 在三嗪侧臂的修饰中，4-氟苯甲胺及呋喃-2-基甲胺取代物更能维持广谱抗性，而双哌嗪类取代则导致活性完全丧失。

作用机制探索

1. 膜功能评价：GC-MS分析表明，28号化合物未显著干扰甾醇代谢，显示其作用机制与传统氮杂类不同。
2. 细胞壁作用：共聚焦显微镜下，28号化合物显著削弱了菌细胞壁甘露聚糖信号并增强几丁质暴露。同时，TEM观察到胞壁结构发生重塑，表明化合物可能通过破坏细胞壁导致真菌死亡。
3. 形态和生物膜：28号化合物在2 μg/ml浓度下显著抑制菌丝生长，在4 μg/ml有效抑制生物膜的形成，但对已成熟生物膜影响有限。

毒性与药代动力学

1. CYCC-8测试和溶血实验显示28号化合物具有较低的细胞毒性和溶血率（显著低于两性霉素B）。
2. 药代动力学分析显示，其半衰期为1.28小时，分布体积为1.08 L/kg，此外，在小鼠肾感染模型中，28号化合物以10 mg/kg的剂量能显著降低真菌负荷。

研究意义和价值

1. 科学意义：首次将三嗪和腙骨架结合以设计广谱新型抗真菌化合物，为抗真菌药物开发提供了全新骨架，并展示了探索菌墙作用机制的重要性。
2. 临床应用前景：28号化合物展现出良好的体内外活性及安全性，未来有望成为治疗侵袭性真菌感染的候选药物。
3. 研究创新：本文不仅在化学结构优化过程中呈现了系统的SAR研究，还探索了新的细胞壁靶向机制，这对解决真菌耐药性有重要启示。

研究亮点与未来展望

1. 28号化合物协同性强、单药疗效优异、毒性低且代谢稳定，展现出极高的研究及应用价值。
2. 今后的工作将集中于明确其具体分子靶点，进一步优化其药代动力学性能及进行临床前验证。

总结来说，这项研究为抗真菌药物研发提供了新思路，同时为解决当前抗真菌治疗中的耐药性问题开辟了新道路。