研究背景与目的

本研究由来自法国留尼汪大学的Arnaud Gaudry、Sandra Bos、Wildriss Viranaicken、Marjolaine Roche、Pascale Krejbich-Trotot、Gilles Gadea、Philippe Desprès和Chaker El-Kalamouni等研究人员完成，另有作者隶属于瑞士日内瓦大学和洛桑大学药学院。该研究成果于2018年4月5日发表在*International Journal of Molecular Sciences*（《国际分子科学杂志》）上，论文题目为《The Flavonoid Isoquercitrin Precludes Initiation of Zika Virus Infection in Human Cells》（黄酮类化合物异槲皮苷阻止寨卡病毒在人类细胞中启动感染）。

寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是一种由蚊媒传播的黄病毒，近年来在南太平洋岛屿和美洲地区引发了大规模流行，并与格林-巴利综合征（Guillain–Barré syndrome）以及感染孕妇所产婴儿的严重先天性畸形密切相关。寨卡病毒还可通过精液和阴道分泌物传播，并可能对性器官造成严重损伤。到目前为止，尚无针对寨卡病毒的疫苗或特效抗病毒治疗药物。寨卡病毒基因组RNA编码一个单一的多聚蛋白，经宿主和病毒蛋白酶加工后产生三种结构蛋白（衣壳蛋白C、膜蛋白prM/M和包膜蛋白E）以及七种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。病毒进入宿主细胞的过程首先依赖于E蛋白与细胞表面特定受体如酪氨酸蛋白激酶受体AXL的结合，随后通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。近年来，从天然产物中寻找抗病毒化合物成为一种经济、简便且环境友好的策略。黄酮类化合物（flavonoids）是植物界中广泛存在的一类多酚物质，具有多种生物活性，其中包括对多种重要医学病毒的抑制作用。已有报道表明，表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate, EGCG）、姜黄素（curcumin）和异槲皮苷（isoquercitrin，即槲皮素-3-O-葡萄糖苷，quercetin-3-O-glucoside，简称Q3G）对寨卡病毒具有抑制作用，但Q3G抑制寨卡病毒的具体机制尚不清楚。本研究旨在阐明Q3G在多种人类细胞中阻断寨卡病毒感染的作用机制，特别是其对病毒进入宿主细胞过程的影响。

研究方法与工作流程

本研究采用了多种人类细胞系，包括人肺上皮细胞A549、人肝癌细胞Huh-7和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，以评估Q3G在不同组织来源细胞中的抗寨卡病毒活性。研究使用了非洲历史株MR766MC（来源于MR766-NIID的病毒克隆）和亚洲流行株PF-25013-18（2013年法属波利尼西亚临床分离株）两种寨卡病毒株，以及携带绿色荧光蛋白报告基因的重组病毒ZIKVGFP。

研究首先通过MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物）法测定了Q3G在三种细胞系中的细胞毒性。结果显示，Q3G在浓度超过200 µM时才会导致细胞活力下降，半数细胞毒性浓度（CC50）分别为A549细胞551.2 µM、Huh-7细胞326.8 µM、SH-SY5Y细胞582.2 µM。在确定非细胞毒性浓度范围后，研究者将寨卡病毒感染与不同浓度的Q3G共同处理细胞，通过免疫荧光法（immunofluorescence assay）检测病毒E蛋白表达、空斑形成实验（plaque-forming assay）定量子代病毒产量、实时定量PCR（RT-qPCR）检测细胞内病毒基因组RNA水平，以及免疫印迹法（immunoblot assay）检测细胞内E蛋白含量。实验结果显示，在100 µM浓度下，Q3G可使PF-25013-18株在A549细胞中的病毒产量降低至少4个log10，细胞内病毒RNA水平降低90%。对MR766MC株而言，Q3G在A549和Huh-7细胞中使病毒产量降低3个log10，而在SH-SY5Y细胞中病毒生长完全被抑制。通过构建浓度-反应曲线获得的半数抑制浓度（IC50）和90%抑制浓度（IC90）显示，Q3G的选择性指数（selectivity index, SI = CC50/IC50）在23至60之间，表明其具有较好的抗病毒选择性。

为探究Q3G作用于寨卡病毒感染周期的具体阶段，研究者首先进行了RNase保护实验和病毒灭活实验。RNase保护实验表明，Q3G处理不会导致病毒颗粒解体或基因组RNA暴露；病毒灭活实验显示，Q3G在37°C下与病毒预孵育2小时并不降低病毒侵染力。这两项结果说明Q3G既不破坏病毒颗粒完整性，也不直接灭活病毒粒子本身。

随后，研究者采用加药时间点实验（time-of-drug addition assay）来确定Q3G靶向的感染阶段。实验设计包括：全程处理（throughout）、与病毒同时加入（co-treatment）、感染前预处理（pre-treatment）和感染后处理（post-infection）四种模式。结果显示，Q3G与病毒同时加入时能显著减少GFP阳性细胞比例，而预处理或感染后加入几乎没有抗病毒效果，这表明Q3G主要作用于病毒感染周期的早期阶段，而非病毒复制、组装或释放阶段。进一步的病毒结合实验（binding assay）中，将预冷的ZIKVGFP与Q3G混合后在4°C下结合到A549细胞表面1小时，然后转移至37°C继续培养，结果显示GFP表达没有差异，说明Q3G不抑制病毒粒子附着到细胞表面的过程。

为了验证Q3G是否抑制病毒内化，研究者在4°C下让ZIKVGFP吸附于A549细胞1小时，随后将温度转移至37°C启动病毒穿入过程，在存在或不存在Q3G的条件下观察不同时间点后GFP阳性细胞比例。在无Q3G情况下，GFP阳性细胞比例随时间线性增加，至45分钟时达到50%，120分钟时达到最大值；而在100 µM Q3G存在时，ZIKVGFP感染的A549细胞始终保持GFP阴性。这说明Q3G是一种快速而有效的病毒内化抑制剂。为了评估Q3G在病毒结合质膜后多早能够抑制内吞作用，研究者在温度转移后的不同时间点加入Q3G，结果显示在温度转移后15分钟内加入Q3G可完全阻断病毒子代产生并使GFP阳性细胞减少90%，而30分钟后加入则抑制作用大大减弱。这表明Q3G介导的抑制作用发生在病毒结合质膜后的极早期，其机制可能是使质膜相关的病毒粒子无法被内化进入宿主细胞。

最后，研究者比较了Q3G与其他结构相关的黄酮类化合物——槲皮素（quercetin）、金丝桃苷（hyperoside）和山柰酚（kaempferol）的抗寨卡病毒活性。结果显示，在最高非细胞毒性浓度下，槲皮素、山柰酚和金丝桃苷对寨卡病毒感染均无显著抑制作用，而Q3G作为阳性对照表现出强烈的抗病毒效果。由于槲皮素是Q3G的苷元（aglycone）且无效，研究者推测糖基部分可能在Q3G抑制病毒进入的能力中起重要作用。特别值得注意的是，带有半乳糖（galactose）糖基的金丝桃苷同样无效，这表明与苷元结合的糖基类型对黄酮类化合物抗寨卡病毒效果具有重要影响。

主要研究结论与意义

本研究首次系统地证明了黄酮醇葡萄糖苷异槲皮苷（Q3G）在多种人类细胞类型中对非洲历史株和亚洲流行株寨卡病毒均具有强效抑制作用，其选择性指数高达60。Q3G的抗病毒机制是阻断寨卡病毒进入宿主细胞的早期阶段——具体而言，是阻止病毒粒子在结合质膜后的内化过程，而非影响病毒的吸附、复制、组装或释放。研究还发现，Q3G的糖基部分对其抗病毒活性至关重要，糖基类型的差异（葡萄糖与半乳糖）决定了黄酮类化合物是否具有抗寨卡病毒能力。

这一发现具有重要的科学价值和应用前景。从科学角度看，该研究阐明了Q3G抗寨卡病毒的具体作用环节，为理解黄酮类化合物抗病毒作用的分子机制提供了新的线索。从应用角度看，异槲皮苷作为一种已在人类中广泛使用的天然化合物，其毒性和药代动力学已有较充分的研究，人体耐受性良好，因此有望作为一种预防寨卡病毒感染的天然抗病毒候选药物进行进一步开发。此外，该研究也为探索Q3G是否对其他重要的蚊媒黄病毒（如登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒和日本脑炎病毒）具有类似的抗病毒作用提出了重要的研究方向。

研究亮点与特色

本研究的亮点在于：第一，首次明确了Q3G抗寨卡病毒的确切作用靶点为病毒内化步骤，而非此前报道的病毒结合或复制环节；第二，通过比较结构相关的黄酮类化合物，揭示了糖基部分——特别是糖基类型——在抗病毒活性中的关键作用，为后续构效关系研究（structure–activity relationship, SAR）指明了方向；第三，Q3G对非洲和亚洲两种基因型寨卡病毒均有效，显示出广谱的抗寨卡病毒潜力。论文最后指出，未来需要深入探讨Q3G是否通过AXL/GAS6介导的网格蛋白依赖内吞途径发挥作用，以及开展系统的构效关系研究以进一步理解黄酮醇葡萄糖苷的抗病毒机制，这些研究方向将为开发针对寨卡病毒及其他医学重要病原体的天然抗病毒药物奠定基础。