心肌缺血再灌注损伤研究重大突破：ZBP1介导心肌细胞泛凋亡新机制

主要作者及发表信息

本研究由复旦大学附属中山医院心内科、上海市心血管病研究所的葛均波（Junbo Ge）院士和孙爱军（Aijun Sun）研究员领衔的团队完成，共同第一作者为张晓凯（Xiaokai Zhang）、宋帅（Shuai Song）、黄子航（Zihang Huang）和曾令奇（Linqi Zeng）。该项研究成果于2025年发表于国际知名学术期刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

研究背景

心肌梗死是全球范围内导致发病和死亡的主要原因。目前标准的治疗方法是紧急血运重建，以恢复缺血心肌的血液供应。然而，再灌注过程本身可能诱导额外的心肌细胞死亡，这种现象被称为心肌缺血再灌注（Ischemia/Reperfusion, I/R）损伤，它实际上抵消了再灌注治疗的部分有益效果。心肌细胞的过度死亡是I/R损伤的根本病理标志。长期以来，凋亡和坏死被认为是主要的细胞死亡形式，但近期研究发现，包括坏死性凋亡（necroptosis）、焦亡（pyroptosis）和铁死亡（ferroptosis）在内的新型调节性细胞死亡形式也参与其中。然而，仅靶向单一类型的细胞死亡被证明对预防I/R损伤效果不佳。

在这一背景下，一种被称为“泛凋亡”（panoptosis）的、高度协调的细胞死亡统一范式被提出。泛凋亡由泛凋亡小体（panoptosome）复合物调控，该复合物能同时展现焦亡、凋亡和坏死性凋亡的分子特征。Z-DNA结合蛋白1（Z-DNA-binding protein 1, ZBP1）是一种核酸感受器，以其能够激活炎症和多种细胞死亡信号通路而闻名。然而，ZBP1在成人心肌细胞中的具体作用，尤其是在没有核酸配体的情况下，此前几乎未被探索。

本研究的目的是：探究ZBP1在心肌I/R损伤中的作用，验证其是否通过诱导心肌细胞发生泛凋亡来加剧损伤，并探索其作为治疗靶点的可能性。

研究流程与详细方法

第一部分：通过整合生物信息学分析鉴定ZBP1的关键作用 * 研究对象与处理： 研究首先对野生型小鼠（Wild-type, WT）建立心肌I/R损伤模型，即结扎冠状动脉左前降支30分钟，然后恢复血流灌注。分别在假手术（sham）后以及再灌注0、1、6、24小时，取心脏缺血区域组织进行时间序列RNA测序（RNA-seq）。 * 实验与分析： 通过主成分分析（PCA）发现缺血期和再灌注期的基因表达谱存在明显分离。研究筛选出在再灌注阶段持续上调的差异表达基因（DEGs），共73个，这些基因在“细胞死亡相关过程”中显著富集。为了验证这些基因的临床相关性，团队进一步分析了公共数据库中人类缺血性心肌病（ischemic cardiomyopathy, ICM）患者的RNA-seq数据集（GSE116250）。通过将小鼠数据与人类数据取交集，锁定了10个重叠基因，其中ZBP1被确定为一个此前在心肌I/R损伤中未被报道过的关键细胞死亡介质。 * 验证： 通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）、蛋白质印迹（Western blot）和免疫组织化学分析，证实了在ICM患者心脏样本中，ZBP1的mRNA和蛋白质水平均显著升高。

第二部分：确定心肌细胞是响应I/R损伤表达ZBP1的主要细胞类型 * 研究对象与处理： 从经历I/R或假手术24小时后的8周龄WT小鼠心脏中分离出心肌细胞和非心肌细胞（包括成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞）。 * 实验与分析： qRT‒PCR和免疫荧光染色结果显示，I/R损伤后，ZBP1的表达在心肌细胞中特异性显著增加，而在其他类型的心脏细胞中未见明显变化。结果表明心肌细胞是导致I/R后心脏ZBP1总体水平升高的主要来源。

第三部分：体外和体内实验证实ZBP1缺失减轻心肌细胞泛凋亡 * 体外实验： * 研究对象： 分离的成年小鼠心肌细胞，通过缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation, H/R）处理模拟体内I/R损伤。 * 关键模型： 为特异性研究心肌细胞中的ZBP1，团队构建了心肌细胞特异性ZBP1条件性敲除小鼠（zbp1fl/flmyh6+），即在心肌细胞中由Myh6-CreERT2系统诱导他莫昔芬（tamoxifen）依赖的Zbp1基因敲除。 * 结果： H/R应激导致心肌细胞中焦亡、凋亡和坏死性凋亡的标志物（如cleaved caspase 3, phosphorylated RIPK3, GSDMD-N）随时间同时上调，呈现典型的泛凋亡表型。而ZBP1缺陷显著抑制了所有这些细胞死亡标志物的激活，减少了碘化丙啶（PI）阳性细胞（膜完整性丧失的标志）、气球样囊泡和乳酸脱氢酶（LDH）释放，降低了caspase 3活性。 * 体内实验： * 研究对象： 对zbp1fl/flmyh6+ 小鼠和对照myh6+ 小鼠进行30分钟缺血/24小时再灌注手术。部分小鼠在术前6小时腹腔注射细胞死亡抑制剂（GSK’872抑制坏死性凋亡，z-VAD-fmk抑制凋亡和焦亡）。 * 结果： 与使用单一细胞死亡抑制剂的治疗相比，心肌细胞特异性ZBP1缺失能使心肌梗死面积（由TTC染色评估）减少得更为显著，血清LDH水平也更低。Evans蓝染色和TUNEL染色也证实ZBP1缺失小鼠的心肌细胞坏死和凋亡更少。此外，在28天的长期观察中，ZBP1缺失小鼠的左心室射血分数（LVEF）更高，心脏纤维化面积更小，表明其长期心脏功能和不良重构得到改善。值得注意的是，髓系特异性ZBP1敲除小鼠并未表现出心脏保护作用，强调了心肌细胞来源的ZBP1在I/R损伤中的核心地位。

第四部分：探索ZBP1的直接致病效应及其分子机制 * 致病效应验证： 为了验证ZBP1过表达是否足以导致心脏损伤，团队构建了心肌细胞特异性ZBP1过表达小鼠（zbp1tgmyh6+）。结果显示，ZBP1过表达在8周内直接导致小鼠出现心脏重构和心力衰竭，表现为LVEF下降、心室腔扩大、心脏纤维化增加，以及自然死亡的发生。分子水平上，同时检测到心肌细胞坏死、凋亡和焦亡指标的激活。 * 机制探究（核心发现）： 通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）实验，研究发现ZBP1过表达会促使其与RIPK3、Caspase 8（Cas8）和Caspase 6（Cas6）发生物理性相互作用，形成了一个由ZBP1/RIPK3/Cas8/Cas6组成的、非经典的泛凋亡小体复合物。而经典的RIPK1、NLRP3和ASC等组分并未参与该复合物的形成。进一步实验表明，RIPK3和Caspase 6对于该复合物的稳定形成至关重要，且ZBP1缺陷会消除H/R应激下RIPK3与Cas8、Cas6的相互作用。

第五部分：筛选并验证新型小分子抑制剂MSB * 虚拟筛选： 研究团队利用AlphaFold预测的小鼠ZBP1蛋白结构，通过Schrödinger软件进行基于结构的虚拟筛选，针对ZBP1的RHIM结构域，对300,000种化合物进行了筛选。 * 实验验证： 表面等离子共振（SPR）技术确认了一种名为MSB的化合物与ZBP1有高结合亲和力（KD=725 nM）。Co-IP实验表明，MSB处理可削弱ZBP1与RIPK3、Cas8和Cas6的相互作用，即破坏了泛凋亡小体的组装。 * 药效评估： 在H/R处理的体外模型和小鼠I/R损伤模型中，MSB均能有效减轻心肌细胞死亡、缩小心肌梗死面积，并改善心脏功能与纤维化。

研究结论与价值

本研究首次全面揭示了ZBP1在成人心肌细胞中通过组装非经典泛凋亡小体（ZBP1/RIPK3/Cas8/Cas6）来驱动泛凋亡，从而加剧心肌I/R损伤的作用机制（详见文中Fig. 7的模式图）。其科学价值在于：1）发现并定义了心肌细胞中一种新型的、不依赖经典炎症小体的泛凋亡调控模式；2）证明了ZBP1本身就足以触发这种多途径的细胞死亡，而无须核酸配体的参与。其应用价值在于：研究表明，靶向ZBP1（如通过基因敲除或使用新发现的小分子抑制剂MSB）能够同时抑制焦亡、凋亡和坏死性凋亡，相较于传统单一细胞死亡途径抑制剂，提供了更优越的心脏保护效果，为治疗心肌I/R损伤提供了极具前景的新策略。

研究亮点 1. 概念创新： 首次将泛凋亡的概念与心肌I/R损伤联系起来，并阐明了其具体的分子调控机器。 2. 机制创新： 揭示了一个由ZBP1主导的、简化的、不依赖RIPK1和NLRP3的“ZBP1/RIPK3/Cas8/Cas6”非经典泛凋亡小体，这区别于在免疫细胞中观察到的复合物，体现了心肌细胞的特殊性。 3. 转化医学潜力： 通过虚拟筛选和实验验证，成功发现了一个全新、高亲和力的ZBP1小分子抑制剂MSB，为开发治疗心肌梗死的新型药物奠定了基础。