本研究所属类型：类型a（单一原创研究）。
本研究由Kyle S. Brown、Hideki Ebihara和Heinz Feldmann共同完成。Kyle S. Brown和Heinz Feldmann隶属于加拿大马尼托巴大学医学微生物学系以及加拿大公共卫生署国家微生物学实验室；Hideki Ebihara和Heinz Feldmann隶属于美国国立卫生研究院国立过敏与传染病研究所落基山实验室病毒学实验室。该研究于2012年4月27日投稿，2012年5月22日被接收，并于2012年7月21日在线发表于《Archives of Virology》（病毒学档案）第157卷第2227至2233页。
该研究属于负链RNA病毒反向遗传学（reverse genetics）领域。安第斯病毒（Andes virus，ANDV）是一种在南美洲发现的高致病性汉坦病毒，属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）汉坦病毒属，可导致汉坦病毒肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome，HPS），人类感染后的病死率可高达50%。然而，由于缺少有效的分子工具和反向遗传学操作系统，对ANDV致病机制的研究长期受到严重限制。反向遗传学系统允许研究者通过更易操作的互补DNA（cDNA）对病毒RNA基因组进行定向改造。其中，微基因组（minigenome）系统通常作为建立全长感染性克隆系统的第一步，可用于分析病毒基因组非编码区（non-coding regions，NCRs）中的顺式作用序列和反式作用蛋白在病毒转录、复制和基因组包装中的功能。在微基因组系统中，病毒基因组的编码区被去除并替换为一个可检测的报告基因，从而简化对非编码区功能的研究，同时可在生物安全二级条件下操作高致病性病原体。此前，针对旧世界汉坦病毒（分布于欧洲和亚洲）以及布尼亚病毒科其他成员的反向遗传学系统已取得部分成功，但针对新世界汉坦病毒的类似尝试尚未见报道。因此，本研究旨在建立首个针对新世界汉坦病毒ANDV的微基因组系统，并描述该系统开发过程中仍然存在的障碍。
本研究的实验流程可分为四个主要环节：ANDV蛋白表达质粒的构建与表达检测、ANDV微基因组质粒的构建、微基因组拯救实验以及条件优化与问题分析。
在第一环节中，研究者从智利分离株9717869中获得ANDV的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）和RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，L）的开放阅读框（open reading frames，ORFs）cDNA。这些ORFs通过一步法RT-PCR扩增后，先插入亚克隆载体pATX-MCS3，再通过PCR扩增并利用含有限制性酶切位点的引物，分别插入四种不同的哺乳动物表达载体：含有鸡β-肌动蛋白（CAG）启动子的pCAGGS、含有T7噬菌体RNA聚合酶启动子的pTM1、含有人巨细胞病毒（CMV）立即早期启动子的gWiz以及含有人延长因子-1α（HEF-1α）启动子的pKS336。同时，由于缺乏针对ANDV L蛋白的抗体，研究者还构建了在L蛋白N端或C端带有FLAG标签的表达质粒。ANDV糖蛋白前体（glycoprotein precursor，GPC）的ORF也被扩增并仅插入pCAGGS表达质粒。在表达检测方面，研究者将上述质粒转染Vero E6或293T细胞，48小时后收集细胞裂解物进行蛋白质印迹（Western blot）分析，并使用针对Gn、Gc和N蛋白的单克隆抗体进行免疫荧光分析（immunofluorescent assay，IFA）以确认蛋白表达。结果显示，N蛋白在Vero E6细胞中通过Western blot和IFA均能成功检测到，不同启动子质粒之间的表达水平相似。Gn和Gc糖蛋白也可通过Western blot和IFA检测到。但是，带有FLAG标签的L蛋白通过Western blot均无法检测到，包括抗FLAG抗体检测以及考马斯亮蓝染色或银染等非免疫染色方法。最终，只有N端FLAG标签的L蛋白在pKS336表达质粒转染后通过IFA以极低水平被检测到，但该结果不能证明全长L蛋白的表达。L蛋白表达低效的原因尚不明确，可能与这一大蛋白表达速率低、转录本被剪接或修饰、蛋白快速被蛋白酶体降解有关，也可能需要其他病毒蛋白的辅助来稳定其表达。
在第二环节中，研究者构建了ANDV微基因组质粒。由于ANDV M片段非编码区较短，研究者通过RT-PCR扩增了包含M片段NCRs以及一小部分编码区的cDNA，并插入pATX-MCS3。随后通过PCR扩增去除编码区部分，并加入氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）或荧光素酶（luciferase，Luc）报告基因。完整的微基因组表达盒由报告基因和两侧的M片段NCRs组成，并以病毒RNA（viral RNA，vRNA）方向克隆入两种不同的表达载体：一种由T7噬菌体RNA聚合酶启动子驱动（pT7-M-CAT），另一种由人RNA聚合酶I（Pol I）启动子驱动（pRF240-M-CAT）。
在第三环节中，研究者将微基因组质粒与L和N蛋白表达质粒（有时也包括GPC）共转染至COS-7细胞中进行微基因组拯救。阴性对照在缺少ANDV蛋白表达质粒或微基因组质粒的条件下进行，阳性对照则为由pCAGGS哺乳动物表达载体表达的报告基因。当使用含T7启动子的质粒时，同时转染表达T7 RNA聚合酶的pCAGGS载体。转染72小时后分析报告信号。结果显示，GFP和Luc微基因组报告表达均未成功检测到。相反，CAT微基因组报告表达可从所有质粒中检测到。在CAT检测中，转染细胞被收集、裂解，细胞提取物与Fast CAT底物试剂和乙酰辅酶A混合，反应产物通过薄层层析（thin-layer chromatography，TLC）分离，并在紫外照射下观察。结果表明，无论使用CMV启动子还是T7启动子驱动ANDV蛋白表达，或使用Pol I启动子驱动微基因组转录，都能成功检测到CAT表达，说明尽管L蛋白表达难以直接检测，但功能性L蛋白确实被产生。不过，使用较弱启动子（如CMV和T7）表达ANDV蛋白或微基因组时，拯救效果优于使用高表达水平的CAG启动子。加入表达ANDV糖蛋白的质粒对拯救效率没有明显影响。研究者还尝试了用ANDV超感染提供辅助蛋白，但未成功。研究者对N、L和微基因组质粒的多种比例进行了优化，并在Vero E6、293T、Huh-7、A549和COS-7等多种细胞系中进行了尝试。
在第四环节中，尽管CAT微基因组拯救取得了成功，但该系统的可重复性一直存在问题。研究者分析了可能的原因。首先，L蛋白表达的不稳定性可能是主要因素。其次，非编码区中可能存在隐秘启动子，这在其他布尼亚病毒中已有描述。第三，非结构蛋白可能影响微基因组复制。序列分析发现ANDV N蛋白ORF中存在两个潜在的非结构蛋白NSs开放阅读框，其中一个最近已被证实为ANDV感染过程中的天然产物。研究者构建了敲除这些潜在ORF起始密码子的N蛋白表达质粒，但NSs敲除并未改善微基因组拯救效果。可重复性差提示仍存在某种汉坦病毒或宿主特异性因子干扰着可靠反向遗传学系统的建立。
综合以上结果，本研究的结论是：成功建立了首个针对新世界汉坦病毒ANDV的微基因组系统。该系统通过CAT报告基因检测到了由ANDV L和N蛋白介导的微基因组转录，证明了所构建的L和N蛋白表达质粒具有功能。然而，由于L蛋白表达不稳定和系统可重复性差，尚不能建立可靠的全长感染性克隆系统。本研究的意义在于：第一，为ANDV的转录和复制机制研究提供了基础工具；第二，为其他新世界汉坦病毒反向遗传学系统的建立提供了参考；第三，明确指出了L蛋白表达效率低和微基因组拯救可重复性差是当前汉坦病毒反向遗传学发展的主要技术障碍；第四，为后续研究聚焦于如何稳定生产L蛋白并寻找可能缺失的宿主或病毒因子提供了方向。
本研究的亮点主要包括：首次报道了新世界汉坦病毒ANDV的微基因组系统；系统性地比较了多种启动子（CAG、CMV、T7、HEF-1α）驱动ANDV蛋白表达以及T7和Pol I启动子驱动微基因组转录的效率；揭示了ANDV L蛋白表达和检测的困难，并提出其可能机制；通过报告基因选择（CAT、GFP、Luc）的比较，发现CAT报告基因的灵敏度更高；尝试敲除潜在NSs ORF以优化系统，尽管未成功但为后续研究排除了部分干扰因素。