本研究由Peter Reid、Nicholas C.K. Heng、John D. Hale、Deepti Krishnan、Julian Crane、John R. Tagg及Trudy J. Milne共同完成，作者团队来自新西兰奥塔哥大学牙科学院Sir John Walsh研究所、BLIS Technologies Limited生物技术公司及奥塔哥大学惠灵顿医学院。研究成果发表于2020年1月的《Journal of Microbiological Methods》，标题为《A TaqMan™-based quantitative PCR screening assay for the probiotic Streptococcus salivarius K12 based on the specific detection of its megaplasmid-associated salivaricin B locus》。

学术背景

研究领域聚焦于口腔益生菌的分子检测技术开发。唾液链球菌K12（Streptococcus salivarius K12）是最早商业化应用的口腔益生菌之一，其通过分泌多种细菌素（如salivaricin A和B）发挥抗菌作用。然而，由于唾液链球菌在口腔中普遍存在，传统培养法无法特异性区分K12菌株与其他共生菌株。此前基于sala基因（编码salivaricin A2）的实时定量PCR（RT-qPCR）检测方法因该基因在致病性化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）中也存在而缺乏特异性。因此，本研究旨在开发一种针对K12菌株特有的salivaricin B编码基因（sbo locus）的高特异性TaqMan™定量PCR检测方法，以评估其定植效率及在宿主体内的持久性。

研究流程

1. 引物与探针设计

   • 靶标选择：基于K12菌株 megaplasmid pssal-K12（GenBank DQ889451）的sbo基因座，选取三个区域——sboa（编码salivaricin B）、sbog和sbok（侧翼转座酶基因区域）作为特异性靶点。
     
   • 设计工具：使用Primer3Plus软件（v2.2.6）设计引物和TaqMan™探针（表1a），其中sboa探针靶向其内部序列，sbog/sbok探针靶向转座酶基因侧翼区（图1）。
     

2. DNA提取与检测体系优化

   • 样本处理：从Todd-Hewitt肉汤过夜培养物中提取基因组DNA（PureLink™试剂盒）。
     
   • 反应体系：
     
     • 双工检测（duplex assay）：包含sboa/sbog引物（600 nM）及探针（200 nM），使用2× Perfecta qPCR ToughMix缓冲液。
       
     • 单工检测（singleplex assay）：针对sbok引物及探针，条件同双工检测。
       
   • 仪器参数：QuantStudio 6 Flex实时PCR系统，循环条件为95℃ 10分钟预变性，40个循环（95℃ 15秒，60℃ 1分钟）。
     

3. 灵敏度与特异性验证

   • 灵敏度测试：K12基因组DNA 10倍梯度稀释（5 ng至0.0005 ng），结果显示sboa/sbog最低检测限为0.005 ng，sbok为0.05 ng。
     
   • 特异性验证：测试11株链球菌（表1b），包括K12（阳性对照）、非K12唾液链球菌（部分含salivaricin B）及Streptococcus mitis SK648（含sboa同源基因）。结果证实仅K12能同时检出sboa、sbog和sbok（Cq值<32），而S. mitis仅sboa阳性（图2）。
     

主要结果

• 三靶标协同检测：通过双工（sboa/sbog）和单工（sbok）联合策略，成功建立高特异性检测体系。三靶标同时阳性方可判定为K12菌株，有效排除S. mitis等交叉反应。
  
• 技术局限性：尝试三工（triplex）检测时sbok无扩增，原因未明，故需分步检测。
  
• 应用验证：该方法可精准区分K12与其他口腔链球菌，为益生菌产品定植效果评估提供可靠工具。
  

结论与价值

本研究开发的TaqMan™ RT-qPCR方法首次实现基于sbo基因座的K12菌株特异性检测，其科学价值在于：
1. 技术突破：克服了传统sala靶标非特异性问题，为益生菌分子监测提供新标准。
2. 应用前景：适用于临床研究（如K12对化脓性链球菌感染的干预效果评估）及产品质量控制。
3. 延伸意义：可筛查其他携带K12类似sbo基因座的菌株，拓展口腔微生物组研究工具。

研究亮点

• 靶标创新：首次利用sbo基因座的三个区域设计联合检测策略，显著提升特异性。
  
• 方法学优化：分步检测方案解决了多靶标扩增效率差异问题。
  
• 跨学科合作：结合分子生物学与临床微生物学需求，推动益生菌研究从实验室到应用的转化。
  

其他价值

本研究受新西兰健康研究委员会资助（项目号13/970），成果亦为后续开发针对其他细菌素的检测方法提供了技术模板。

（注：文中专业术语如“megaplasmid”译为“巨型质粒”，“lantibiotic”译为“羊毛硫抗生素”，“Cq值”保留英文缩写，首次出现时标注原文。）