本文报告了一项原创性研究，作者为Gustavo de Medeiros、Raphael Ortiz、Petr Strnad、Andrea Boni、Franziska Moos、Nicole Repina、Ludivine Challet Meylan、Francisca Maurer及Prisca Liberali，主要来自Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research（FMI）和University of Basel。该研究于2022年发表在 Nature Communications 期刊上，文章标题为“Multiscale light-sheet organoid imaging framework”。
该研究属于类器官（organoid）活体成像与计算生物学交叉领域。类器官是一种体外三维细胞培养体系，能够在很大程度上模拟体内组织的再生与发育过程，特别是肠道类器官可以重现肠道上皮的再生反应以及隐窝（crypt）和绒毛（villus）结构的形成。然而，对类器官进行长期活体成像一直面临技术挑战：一方面需要能够长时间稳定成像多种样本的显微技术，另一方面还需要能够处理复杂三维图像数据的分析流程。此前的研究多关注特定生物学问题或仅提供单一工具，缺乏从成像到数据分析再到可视化的统一多尺度框架。因此，本研究的目标是建立一个完整的多尺度光片成像框架，将成像优化、图像预处理、半自动谱系追踪、分割、特征提取和可视化整合在一起，从而将肠道类器官的长期光片成像数据转化为“数字类器官”（digital organoid），并进一步用于解析类器官生长过程中的细胞与组织尺度动态。
研究的整体工作流程包括以下几个主要环节。首先是成像框架的建立。作者使用双照明倒置光片显微镜对表达H2B-mCherry（组蛋白标记细胞核）和mem9-GFP（膜肽标记细胞膜）的小鼠肠道类器官进行长时间成像。为了解决样本在基质胶（Matrigel）中因折射率不匹配以及样本位置不同导致的光束对准问题，作者开发了位置依赖的照明对准步骤，可以针对每个样本位置分别调整照明片与检测平面的对准，从而提高图像信噪比。样本被培养在带有微孔的氟化乙烯丙烯（FEP）薄膜上，微孔结构可以稳定样本位置并防止在换液或固定过程中样本脱落。成像采集到的数据会经过自动裁剪以减少存储需求，同时校正三维样本漂移；随后进行基于Noise2Void的去噪和基于测量的点扩散函数（PSF）的反卷积处理，以提高图像质量。研究记录了多个从单细胞或四细胞球开始生长的类器官，时间间隔为10分钟，持续约4天，最终获得包含出芽型（budding）和肠囊型（enterocyst）类器官的数据集。
第二个环节是图像处理工作流的构建。作者开发了一个名为LSTree的统一工作流，整合了裁剪、去噪、反卷积、分割、追踪和特征提取等模块。在分割方面，研究采用RDCNet实例分割网络，利用递归结构进行三维细胞核分割。为了减少手工标注量，作者使用了完整标注与部分标注混合训练的策略：对少量帧进行完整细胞核手工标注，而对大部分帧仅利用Mastodon追踪得到的细胞核位置绘制球体作为部分标注。细胞分割也使用RDCNet，并利用已预测的细胞核作为部分细胞标注，同时结合管腔（lumen）和上皮（epithelium）分割作为约束，以避免细胞标签扩散到上皮层之外。此外，研究提取了多种特征，包括细胞核到顶端/基底膜的距离、荧光强度、到母节点的距离以及每个细胞的邻居数目等。
第三个环节是自动谱系追踪。研究在已有的半自动追踪数据集上训练了一个深度学习模型，用于自动生成候选谱系树。该模型扩展了RDCNet，使用三维卷积网络并将时间轴作为额外的图像通道，同时预测连续两帧之间的细胞核匹配关系，生成伪四维标签。通过最大重叠匹配将各帧的细胞核标签连接成完整的谱系树。预测结果以Mamut.xml格式保存，可导入Mastodon进行手动校正。该方法的优势在于通过整核体积的一致性来约束追踪，减少了对人工超参数调节的依赖。研究显示，该追踪策略可以预测长达五代的分裂谱系，并且在小鼠胚胎数据集上也验证了其泛化能力。
第四个环节是数字类器官查看器的开发。作者构建了一个基于网页的交互式可视化工具，可以同时显示谱系树和分割得到的三维网格（mesh），并允许独立地为树和网格分配颜色编码。用户可以通过该工具直接比较不同特征在多尺度数据中的表现，例如核体积随代数（generation）的变化、细胞核到基底膜的距离变化等。该工具也支持将原始图像与分割网格叠加显示，便于检查分割质量。
在获得上述工具后，研究进一步结合固定和免疫标记进行功能分析。作者在活体成像结束后对样本进行固定，并利用免疫染色检测特定标记物。由于固定会导致基质胶液滴变形和类器官位移，作者在固定过程中持续成像，并使用Elastix进行相似变换配准，将固定后的图像与活体成像的最后一帧对齐。在一项实验中，作者追踪了两个Dll1阳性（Dll1+）细胞，发现它们是在固定前约10小时由同一母细胞分裂产生的姐妹细胞。进一步分析显示，这两个Dll1+姐妹细胞在进入第六代后，其核体积出现差异，其中Lysozyme阳性（Lys+）细胞的核略大。邻居分析表明，这些细胞在生长过程中邻居交换并不频繁，平均维持约五个邻居细胞。
在生物学发现方面，研究揭示了肠道类器官早期生长过程中存在细胞分裂失败导致的核合并事件。通过谱系树分析，作者发现多个数据集中至少存在一次两个姐妹核在细胞周期结束时未完全分开而再次合并的事件。这些合并事件的共同特征是上一次有丝分裂晚期胞质分裂（cytokinesis）失败。合并后的子代细胞核体积和细胞体积均明显增大，呈现四倍体特征。通过对照实验排除了光毒性导致的假象。更重要的是，作者发现这些经历胞质分裂失败的细胞后代虽然有一部分会被挤出到管腔中（约46%，而正常细胞仅约5%），但仍有54%的细胞能够继续作为上皮细胞存活至成像结束。然而，这些存活的细胞从未定位在隐窝区域，而总是出现在绒毛区域。这一结果提示存在一种组织尺度的调控机制，能够将可能存在染色体异常的细胞排除在干细胞生态位之外，从而维持隐窝中细胞的遗传完整性。在分子机制上，作者发现LATS1激酶可以通过抑制LIMK1来调控胞质分裂失败。使用LATS1抑制剂TRULI可以增加双核细胞数量，而使用LIMK1抑制剂Damnaconthal则减少双核细胞数量，表明LATS1-LIMK1通路在肠道类器官形成过程中调控胞质分裂失败。
本研究的结论是，LSTree框架能够将类器官的长期光片成像数据转化为包含谱系信息和空间分割信息的多尺度数字类器官，从而实现在同一体系中同时分析组织尺度与单细胞尺度的动态变化。该框架不仅适用于肠道类器官，也可推广至其他三维细胞培养系统。研究的科学价值在于提供了一个统一且可扩展的多尺度分析工具，弥补了以往类器官成像研究中缺乏整合分析平台的不足；同时，通过将固定免疫标记与活体追踪相结合，研究展示了如何在时间与空间上回溯特定功能细胞的历史。在应用价值方面，该框架有助于未来建立标准化的数字类器官图谱，以克服类器官培养中的固有变异性。此外，研究提出的组织尺度检查点假说为理解再生与癌症之间的相互作用提供了新的视角。
本研究的亮点包括：开发了位置依赖的照明对准方法以优化光片成像质量；建立了基于深度学习的联合分割与追踪策略，显著减少了人工标注和追踪时间；构建了统一的LSTree工作流和数字类器官查看器，实现了多尺度数据的交互式可视化；发现了肠道类器官早期生长中胞质分裂失败导致的核合并事件，并揭示了这些细胞在隐窝与绒毛区域的不同命运，提示组织尺度上存在维持干细胞生态位完整性的机制。