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Bio-Rad IQ-Check大肠杆菌O157:H7和STEC VirX及STEC Sero检测试剂盒的改进与基质扩展

期刊:Journal of AOAC INTERNATIONALDOI:10.5740/jaoacint.19-0254

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Bio-Rad公司IQ-Check实时PCR检测试剂盒的改进与基质扩展研究

作者及机构
本研究由Bio-Rad Laboratories的Mike Clark、Jean-Philippe Tourniaire、Sophie Pierre和Christophe Quiring主导,独立实验室验证由Q Laboratories, Inc.的Dane Brooks、Benjamin Bastin、Erin Crowley和James Agin完成。论文于2020年发表在*Journal of AOAC International*(第103卷第1期),DOI为10.5740/jaoacint.19-0254。

学术背景
研究领域为食品安全微生物检测技术,聚焦于产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing E. coli, STEC)的快速检测。美国疾控中心数据显示,每年约4800万人因食源性疾病感染,其中STEC(包括O157和非O157血清型)是主要致病菌之一。传统检测方法耗时长且操作复杂,而实时PCR技术因其高灵敏度和特异性成为替代方案。Bio-Rad的IQ-Check系列试剂盒(包括E. coli O157:H7、STEC VirX和STEC Sero)已通过AOAC Performance Tested Method(PTM)认证,但需扩展其检测基质范围并优化前处理流程。本研究旨在验证试剂盒在更大样本量(375 g生牛肉、菠菜)和新基质(鸡肉、猪肉)中的性能,同时改进富集方案(以缓冲蛋白胨水BPW替代STEC富集肉汤)。

研究流程
1. 方法改进与验证设计
- 目标菌株:包括O157:H7、非O157 STEC(O26、O45等6种血清型)及沙门氏菌(作为共富集对照)。
- 基质选择:生碎牛肉(17%脂肪)、牛肉修整肉、新鲜菠菜(375 g);无皮鸡胸肉、带皮鸡腿肉、机械分离鸡肉、生碎猪肉(25 g)。
- 富集方案:BPW中41.5°C富集8–22小时(菠菜10–22小时),采用Free DNA Removal Solution去除游离DNA。

  1. 包容性与排他性测试

    • 包容性:50株STEC(含O157和非O157)在BPW中富集8小时后,稀释至检测限(LOD50)水平,所有目标菌株均被准确检出。
    • 排他性:30株非目标菌(如*Alcaligenes faecalis*、*Pseudomonas aeruginosa*)未产生交叉反应。
  2. 基质比较研究

    • 接种设计:每基质30份样本(5份未接种、20份低接种0.2–2 CFU/份、5份高接种2–10 CFU/份),通过MPN(最大可能数)法量化接种水平。
    • 检测流程
      • DNA提取:使用IQ-Check Prep自动化平台,结合Free DNA Removal Solution处理样本。
      • PCR扩增:CFX96 Touch深孔实时PCR系统检测,针对O157(*rfbE*基因)、非O157(*stx1*、*stx2*、*eae*毒力基因及血清型特异性标记)。
      • 结果确认:22小时富集后,通过USDA-FSIS/MLG 5.09(肉类)或FDA/BAM 4a(菠菜)参考方法进行培养确认。
  3. 数据分析

    • 概率检测(POD)分析:比较候选方法与参考方法的POD差异(ΔPOD),置信区间不包含0视为显著差异。
    • 统计标准:依据AOAC附录J,要求低接种水平下获得部分阳性结果(5–15/20)。

主要结果
1. 包容性/排他性:所有目标菌株检出率100%,非目标菌均无假阳性(表1、2)。
2. 基质性能
- 生碎牛肉/牛肉修整肉:O157和非O157 STEC在8小时和22小时富集后,ΔPODc(候选vs参考方法)和ΔPODcp(预设vs确认结果)均无显著差异(表3)。例如,生碎牛肉低接种组中,IQ-Check检出6/20(O157)和11/20(非O157),与参考方法(7/20和5/20)统计等效。
- 菠菜:10小时富集即可达到22小时的检测灵敏度,O157检出率12/20(低接种),与参考方法(10/20)一致。
- 鸡肉/猪肉:25 g样本中O157检出率与参考方法无差异(如鸡胸肉低接种组:IQ-Check 1120 vs 参考方法8/20)。
3. 时间效率:8小时富集结果与22小时完全一致,无需延长培养。

结论与价值
1. 科学价值:证实BPW富集结合Free DNA Removal Solution可替代传统STEC肉汤,显著缩短检测时间(8小时 vs 传统24小时)。
2. 应用价值
- 扩展试剂盒至375 g大样本检测,满足食品安全监管需求。
- 实现单一富集同时检测O157和非O157 STEC,降低成本。
3. 技术亮点
- 首创“共享富集”流程:STEC VirX与Sero试剂盒共用同一DNA提取物,提升效率。
- Free DNA Removal Solution有效消除死菌DNA干扰,降低假阳性。

研究亮点
1. 方法学创新:首次在AOAC PTM认证中验证BPW对STEC的富集效能。
2. 跨基质适用性:覆盖肉类、禽类、蔬菜三类高风险基质,检测限低至0.2 CFU/份。
3. 自动化整合:IQ-Check Prep与CFX96系统实现“样本进-结果出”全流程自动化,适合高通量实验室。

其他价值
- 沙门氏菌共富集数据(未在本文详述)提示该方法可进一步开发多重检测面板。
- 研究数据支持AOAC于2019年8月2日批准该方法修改(PTM 020801和121203)。


此报告完整呈现了研究的学术逻辑与技术细节,为同行提供了方法优化与验证的范本。

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