本研究由Chunfeng Li、Yong-Qiang Deng、Shuo Wang等多位学者合作完成，主要通讯作者为Genhong Cheng（UCLA）、Cheng-Feng Qin（北京微生物与流行病学研究所）、Zhiheng Xu（中国科学院遗传与发育生物学研究所）和Bennett G. Novitch（UCLA）。论文发表于*Immunity*期刊，2017年3月21日出版，题为“25-hydroxycholesterol protects host against zika virus infection and its associated microcephaly in a mouse model”。
一、研究背景
寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）因全球传播范围的扩大及其与新生儿小头畸形（microcephaly）等严重先天性疾病的关联，已成为全球公共卫生的重大威胁。孕妇宫内感染ZIKV可导致胎儿小头畸形、自然流产及宫内生长受限。ZIKV感染神经祖细胞（neural progenitor cells, NPCs）后可引起细胞死亡和细胞周期阻滞，最终导致皮层变薄和小头畸形。然而，目前尚无批准的抗病毒药物或疫苗用于防治ZIKV感染。宿主对ZIKV的免疫应答尚未被完全阐明。I型干扰素（type I interferon, IFN）信号通路在抗病毒免疫中发挥重要作用，可通过诱导大量干扰素刺激基因（interferon-stimulated genes, ISGs）来抑制病毒感染。已有研究表明IFITM1和IFITM3可抑制ZIKV早期感染，但其他ISGs的作用仍不明确。胆固醇-25-羟化酶（cholesterol-25-hydroxylase, CH25H）是一种ISG，其酶促产物为25-羟基胆固醇（25-hydroxycholesterol, 25HC）。此前研究已发现CH25H及25HC可抑制水疱性口炎病毒、人类免疫缺陷病毒和埃博拉病毒等多种病毒，但其在ZIKV感染中的作用尚不清楚。本研究的目的是系统评估CH25H及25HC在抗ZIKV感染中的作用及其潜在防治价值。
二、研究流程
本研究通过多个体外和体内模型层层验证25HC的抗ZIKV作用。首先，研究者在A549细胞中进行RNA测序（RNA-seq），发现ZIKV感染显著上调多个ISGs，其中CH25H表达明显升高。通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）验证，ZIKV感染剂量依赖性地诱导CH25H表达，同时IFN-β也能上调CH25H。利用CRISPR/Cas9技术构建CH25H敲除的A549细胞，发现敲除CH25H后ZIKV复制显著增强；在HeLa细胞中过表达CH25H则显著抑制ZIKV复制，而酶活性丧失的CH25H突变体（CH25H-m）无此抑制作用，说明25HC的产生对抗病毒功能至关重要。进一步通过质谱确认CH25H过表达细胞上清中存在25HC。竞争性膜融合实验表明25HC通过阻断病毒-细胞膜融合抑制ZIKV入侵。研究者还检测了25HC对其他黄病毒的抑制作用，使用Vero细胞和BHK-21细胞进行空斑实验、qRT-PCR和免疫荧光分析，结果显示25HC对登革病毒、黄热病毒和西尼罗病毒均有广谱抑制作用，其对ZIKV的半数抑制浓度（IC50）为188 nM。病毒内化实验和合胞体形成实验进一步证实25HC不阻断病毒与细胞结合，而是抑制病毒进入。人工脂质体竞争实验表明25HC的作用与细胞膜修饰有关。ZIKV和DENV复制子实验显示25HC不影响病毒RNA复制，说明其靶点在病毒进入阶段而非复制阶段。
在体内实验中，首先使用免疫完整的BALB/c小鼠，通过腹腔注射25HC（50 mg/kg）预处理后感染ZIKV，发现血清病毒载量显著下降。随后在IFN-α/β受体缺陷的A129小鼠模型中进一步验证，25HC治疗显著提高存活率并减少脑内病毒载量。在恒河猴模型中，25HC（1.5 mg/kg/天静脉注射）预处理组在血清和尿液中均未检测到ZIKV RNA，而对照组出现明显病毒血症和病毒尿症。高剂量攻毒实验中，25HC治疗组未出现发热，且病毒血症和尿液排毒时间缩短。细胞因子检测显示25HC可降低IFN-γ、IL-15和CXCL9等炎症因子的释放。
在人脑类器官（human cortical organoids, hCOs）模型中，ZIKV感染可诱导IFN-β和CH25H表达，而25HC预处理显著抑制ZIKV复制，2.5 μM浓度下病毒基因组RNA减少90%以上。免疫荧光也证实25HC几乎完全保护脑类器官免受ZIKV感染。在胎鼠小头畸形模型中，孕鼠在胚胎第13.5天脑内注射ZIKV，25HC治疗显著减少感染细胞数量和病毒RNA水平，减轻皮层变薄和侧脑室扩大的程度，恢复部分神经元密度。25HC治疗还挽救ZIKV感染导致的神经祖细胞增殖减少和细胞凋亡增加。安全性评价显示25HC在体外对Vero细胞无显著毒性，对孕鼠体重和妊娠无不良影响，治疗剂量下无肝毒性。
三、主要结果
研究首先通过RNA-seq和qRT-PCR证实ZIKV感染可在A549细胞中剂量依赖性诱导CH25H表达，且IFN-β处理可上调CH25H。CRISPR/Cas9敲除CH25H后，ZIKV复制显著增强；过表达CH25H显著抑制ZIKV复制，而酶活性失活的CH25H-m无此作用，表明CH25H通过其代谢产物25HC发挥抗病毒功能。质谱分析确认25HC的存在。体外抗病毒实验显示25HC可广谱抑制ZIKV、DENV、YFV和WNV的感染，IC50处于纳摩尔至微摩尔水平。病毒结合实验显示25HC不抑制病毒附着于宿主细胞，内化实验显示25HC剂量依赖性地阻断病毒内化，合胞体形成实验也证明25HC抑制病毒介导的细胞膜融合。脂质体竞争实验提示25HC可能通过插入细胞膜发挥作用。复制子实验显示25HC不影响病毒RNA复制，进一步证明其作用在病毒进入阶段。小鼠实验中，25HC治疗显著降低血清病毒载量，提高A129小鼠存活率，减轻脑内病毒载量。恒河猴实验中，25HC能完全抑制低剂量攻毒后的病毒血症和病毒尿症，高剂量攻毒时也能缩短病毒血症及尿液排毒时间并抑制发热和炎症因子升高。人脑类器官实验中，25HC处理后ZIKV复制显著降低，组织损伤减少。胎鼠小头畸形模型中，25HC减少了脑内病毒感染，改善了皮层结构、神经元数量及细胞增殖和凋亡指标。
这些结果逐层推进：从分子水平的CH25H诱导和抗病毒活性验证，到体外多种细胞模型确定25HC阻断病毒进入的机制，再到小鼠和猴体内药效验证，最后在脑类器官和胎鼠模型中验证其对神经系统保护作用，形成了完整的证据链。
四、结论与意义
本研究首次系统证明了CH25H在宿主抗ZIKV免疫中的保护作用，并阐明其酶促产物25HC通过阻断病毒进入细胞而发挥抗病毒功能。25HC可显著降低小鼠和恒河猴体内的病毒载量，改善存活率，并能保护人脑类器官和胎鼠免受ZIKV感染及小头畸形的损害。由于25HC是一种内源性甾醇，可穿过细胞膜和血脑屏障，具有作为一线广谱抗病毒药物的潜力。该研究为防治ZIKV感染及其相关神经系统疾病提供了重要的实验依据和候选药物。
五、研究亮点
本研究的亮点包括：首次证明CH25H/25HC在体内外对ZIKV感染的保护作用；揭示25HC通过阻断病毒进入阶段而不是抑制病毒复制发挥抗病毒活性；在多种模型系统中验证了25HC的广谱抗黄病毒活性；首次展示25HC对ZIKV所致小头畸形的预防效果；25HC的天然来源和可透过血脑屏障的特性使其具有良好的成药潜力。此外，研究还发现25HC可降低病毒感染引起的炎症因子水平，提示其可能兼具抗炎作用。