S100A4通过PI3K/Akt/Nrf2通路减轻缺血性脑卒中血脑屏障损伤与氧化应激的神经保护作用研究

第一作者及单位
本研究由Jiyu Ji（第一作者，新乡医学院第一附属医院神经内科）与Xiao Li（共同第一作者，南京大学医学院附属金陵医院药学部）领衔，合作作者包括Rong Zhang、Jingjing Zhang等，发表于*Biochemical and Biophysical Research Communications*期刊（2025年卷742期，文章编号151099）。

学术背景
缺血性脑卒中（ischemic stroke）是全球致残和致死的主要病因，其病理机制涉及氧化应激（oxidative stress）和血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）损伤。尽管已有研究揭示抗氧化和BBB保护策略的潜力，但调控这些过程的关键分子机制仍不明确。S100A4是一种钙结合蛋白，既往研究提示其在神经分化、突触可塑性中发挥作用，但其在脑卒中中的功能尚未阐明。本研究基于临床患者和动物模型，首次揭示S100A4通过激活PI3K/Akt/Nrf2通路减轻氧化应激和BBB损伤的神经保护机制，为缺血性脑卒中的治疗提供新靶点。

研究流程与方法
1. 临床与动物模型验证S100A4表达
- 样本：收集缺血性脑卒中患者血清（样本量未明确）及健康对照，建立小鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型（n=6/组）。
- 方法：通过RNA测序发现MCAO小鼠脑组织中S100A4显著上调；ELISA检测患者血清S100A4水平，并与美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分关联。
- 关键技术：采用qPCR和Western blot动态监测S100A4在MCAO后1、3、7天的表达趋势。

1. S100A4功能缺失与过表达实验

   • 动物分组：假手术组（Sham）、Sham+shRNA-S100A4组、MCAO组、MCAO+shRNA-S100A4组、MCAO+OE-S100A4组（每组n=6）。
     
   • 基因操作：通过立体定位注射腺相关病毒（AAV）敲低或过表达S100A4，2周后诱导MCAO模型。
     
   • 行为学评估：Longa评分、改良神经功能缺损评分（mNSS）、转棒实验（rotarod）、握力测试，评估神经功能缺损程度。
     

2. 氧化应激与BBB完整性检测

   • 氧化标志物：ELISA检测血清丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）；免疫组化分析脑组织4-羟基壬烯醛（4-HNE）表达。
     
   • BBB通透性：伊文思蓝（Evans blue）渗出实验；qPCR和Western blot检测紧密连接蛋白（occludin、claudin-5、ZO-1）表达。
     

3. 机制解析

   • 生物信息学分析：通过STRING数据库筛选S100A4相互作用蛋白，结合GeneCards卒中相关基因，锁定PI3K/Akt/Nrf2通路。
     
   • 实验验证：Western blot检测PI3K、Akt磷酸化水平及Nrf2核转位；免疫荧光观察Nrf2亚细胞定位；下游抗氧化基因（HO-1、NQO1）表达分析。
     

主要结果
1. S100A4在卒中中的表达特征
- 临床患者血清及MCAO小鼠脑组织中S100A4显著升高，且与卒中严重程度正相关（p<0.01）。
- 时间依赖性分析显示，S100A4在MCAO后7天达峰值（Western blot数据支持）。

1. 功能缺失加剧损伤

   • shRNA-S100A4组小鼠神经功能评分恶化（mNSS升高2.5倍，p<0.001），脑水肿加重（湿/干重比增加30%），BBB通透性显著上升（Evans blue渗出量增加45%）。
     
   • 氧化应激标志物MDA和4-HNE阳性细胞数增加（p<0.01），提示S100A4缺失加剧自由基损伤。
     

2. 过表达S100A4的保护效应

   • OE-S100A4组紧密连接蛋白表达恢复至Sham组80%（occludin、claudin-5上调1.8倍），神经功能改善（rotarod潜伏期延长2倍，p<0.05）。
     

3. PI3K/Akt/Nrf2通路激活

   • S100A4敲低抑制PI3K/Akt磷酸化（Western blot显示p-Akt下降60%），减少Nrf2核转位（免疫荧光定量下降50%），导致下游HO-1表达降低。
     
   • 生物信息学与实验共同证实该通路为S100A4的核心作用靶点。
     

结论与价值
本研究首次阐明S100A4通过激活PI3K/Akt/Nrf2轴减轻氧化应激和BBB损伤的神经保护机制。其科学价值在于：
1. 理论创新：揭示S100A4在卒中中的内源性保护角色，拓展了钙结合蛋白的神经保护功能认知。
2. 应用潜力：S100A4可作为卒中治疗新靶点，其激动剂或基因疗法具有转化前景。
3. 方法学贡献：整合临床-动物-生物信息学多维度验证，为类似研究提供范式。

研究亮点
1. 跨物种验证：从患者血清到小鼠模型，双向验证S100A4的病理关联性。
2. 机制深度：通过基因操作结合通路分析，明确PI3K/Akt/Nrf2的级联调控网络。
3. 治疗启示：提出靶向S100A4以协同调控氧化应激和BBB的双重保护策略。

局限性与展望
研究未涉及慢性期S100A4的作用，且PI3K/Akt通路下游其他靶点（如mTOR）的交互机制需进一步探索。未来可开发S100A4特异性激动剂，并评估其联合溶栓治疗的协同效应。