本项研究由一支跨多学科的研究团队完成。通讯作者包括来自北京大学人民医院关节炎临床与研究中心及关节炎研究所的Dan Xing和Jianhao Lin，以及来自清华大学医学院生物医学工程系、清华-北大生命科学联合中心的Yanan Du。第一作者是Zhen Yang（北京大学人民医院、北京大学关节炎研究所）和Bin Wang（浙江大学医学院附属第一医院）。其他作者分别来自清华大学、悉尼科技大学、北京大学深圳医院、山西医科大学第二附属医院以及北京赛傲生物科技有限公司等多个机构。这项研究发表于期刊 bioactive materials 第27卷（2023年），具体出版日期为2023年4月2日在线接收。

本研究的学术背景聚焦于组织工程和再生医学领域，具体针对骨软骨缺损修复这一重大临床挑战。骨软骨单元由结构、成分和功能截然不同的透明软骨、钙化软骨和软骨下骨组成，具有复杂的层级结构。由于软骨和骨的愈合能力不同，且界面整合困难，实现骨软骨的同时再生极具挑战性。传统的策略通常依赖于构建具有双相、三相或多层结构的支架，但这些支架往往存在层间分离、无法再生钙化软骨和梯度结构等问题。近年来，新兴的类器官技术为再生医学带来了新机遇。类器官能够模拟器官的复杂结构和功能，但其在骨软骨领域的应用仍面临挑战，特别是如何在空间上定向、可控地诱导间充质干细胞分化为软骨和骨细胞，并形成整合良好的双层结构。研究团队先前曾开发出可注射的微低温凝胶，它能提供三维微环境，促进细胞增殖、干细胞特性维持，并能自组装成功能性组织构建体。基于此背景，本研究旨在开发一种无需依赖大块支架或昂贵生长因子的新型策略，通过设计和构建功能定制化的微低温凝胶，引导间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）进行空间定向分化，并使其在体内自组装成骨软骨类器官，从而实现对关节软骨和软骨下骨的同步、层次化再生。研究的核心目标是验证这种“定制化微低温凝胶引导原位自组装形成骨软骨类器官”方法的可行性和有效性。

本研究的设计与工作流程严谨而系统，主要分为七个关键环节： 第一，定制化微低温凝胶的制备与表征。 研究团队以明胶为基础材料，分别引入透明质酸（Hyaluronic Acid, HA）和羟基磷灰石（Hydroxyapatite, Hyp）进行功能化定制。添加HA的微凝胶旨在促进软骨形成，命名为CH-微低温凝胶；添加Hyp的微凝胶旨在促进成骨，命名为OS-微低温凝胶；未添加任何功能成分的明胶微凝胶作为对照微低温凝胶。制备过程采用了团队先前报道的激光加工聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微模具阵列芯片技术，通过冷冻、脱模、洗涤和冻干得到多孔微凝胶。通过扫描电子显微镜（SEM）观察，所有微凝胶均具有相互连通的多孔结构，但孔径和直径存在差异，CH-微凝胶和对照微凝胶的孔径较大，OS-微凝胶的孔径较小且直径更小。水吸收率测试显示，对照微凝胶最高，CH-微凝胶次之，OS-微凝胶最低，这与其成分和结构密度相关。细胞活力实验（活/死染色）证实了三种微凝胶均具有良好的细胞相容性。有趣的是，由于密度差异，CH-微凝胶在PBS溶液中漂浮，而OS-微凝胶下沉，这一物理特性为后续的层序注射和分层自组装提供了便利。 第二，微凝胶内间充质干细胞的定向预分化诱导。 将人间充质干细胞接种到上述三种微凝胶上，并分别使用标准的软骨形成诱导培养基（针对CH-微凝胶）和成骨诱导培养基（针对OS-微凝胶）培养7天，进行预分化。研究设置了相应的对照（在对照微凝胶中进行相同诱导）。通过组织化学染色和基因表达分析评估分化效果。结果显示，与对照微凝胶相比，CH-微凝胶能更有效地诱导软骨分化，表现为更强的甲苯胺蓝和阿利新蓝染色阳性，以及更高的软骨相关基因（COL2, SOX9）表达。同样，OS-微凝胶表现出更强的成骨诱导能力，茜素红染色显示更多的钙结节形成，碱性磷酸酶（ALP）活性定量检测和成骨基因（RUNX2）表达也更高。原子力显微镜（AFM）检测发现，经过7天诱导后，三种微凝胶的杨氏模量从低到高依次为：对照微凝胶、CH-微凝胶、OS-微凝胶，表明OS-微凝胶能形成更坚硬的微环境。细胞骨架（F-actin）染色进一步揭示了细胞在不同微环境中的形态差异：CH-微凝胶中的细胞骨架纤维更短、更分散；而OS-微凝胶中的细胞骨架纤维更长、更粗、更具方向性。这些结果证实了定制化微凝胶能够为MSCs提供特定的微环境，有效引导其向软骨或骨谱系定向分化。 第三，体外自组装形成骨软骨类器官。 将经过7天预分化的CH-微凝胶（软骨层）和OS-微凝胶（骨层）依次注入一个3D打印的网格框架中，然后使用软骨和成骨混合诱导培养基继续培养7天，使其自组装成一个整体的骨软骨类器官。SEM观察显示，自组装后的类器官具有贯通的多孔结构，且软骨层与骨层界面区域整合良好，未见明显分层。细胞示踪实验（用不同荧光染料标记两种微凝胶中的细胞）证实，自组装后，软骨层和骨层的细胞分别保留在各自的微凝胶区域内，没有发生大规模混合，维持了分区的细胞分布。活/死染色显示类器官内细胞存活率很高。将组装好的类器官沿轴向切开，分别分析其软骨部分和骨部分，发现与单独培养的预分化微凝胶相比，自组装后的类器官各部分的软骨/成骨特异性基因表达（如ACAN, COL2, SOX9, ALP, RUNX2, OCN）均显著上调，表明自组装过程进一步强化了细胞的定向分化表型。此外，将两种微凝胶分别皮下植入裸鼠背部，一周后组织学分析显示，OS-微凝胶内部有新生血管长入，而CH-微凝胶内部则没有，这与其在体内分别模拟成骨（需要血供）和软骨（通常无血管）的生理功能相符。AFM力学测试也证实，自组装类器官的骨层部分杨氏模量显著高于软骨层部分和整个类器官，符合天然骨软骨组织的力学梯度特性。 第四，分子机制探索：mRNA测序分析。 为了深入探究定制化微凝胶引导MSCs命运决定的分子机制，研究团队对经过7天诱导后的对照微凝胶、CH-微凝胶和OS-微凝胶中的细胞进行了mRNA测序分析。生物信息学分析揭示了丰富的差异表达基因和信号通路。对于软骨分化，与对照相比，CH-微凝胶中的MSCs上调了与软骨细胞增殖相关的基因和通路，如Hedgehog和Rap1信号通路；同时显著下调了多个与炎症和免疫反应相关的通路，如NF-κB、IL-17、TNF信号通路。这提示CH-微凝胶不仅促进软骨形成，还可能创造一个抑制炎症的微环境。对于成骨分化，OS-微凝胶中的MSCs则显著上调了多个与骨发育、成骨细胞分化和骨矿化相关的通路，包括PI3K-Akt、FoxO、TGF-β、MAPK和Wnt信号通路；而细胞凋亡相关的p53信号通路则被下调。值得注意的是，TGF-β、PI3K-Akt和MAPK信号通路在CH-微凝胶中呈现下调，在OS-微凝胶中呈现上调，表明这两种定制化微凝胶可能通过差异调节这些关键的信号通路来实现对MSCs命运的精确、反向调控。 第五，体内动物实验验证修复效果。 研究在一个大型动物模型——比格犬股骨滑车沟的骨软骨缺损模型中，评估了该策略的体内修复效果。实验分为三组：空白对照组（不处理）、对照组（注射负载未分化MSCs的对照微凝胶）、实验组（即骨软骨类器官组：先注射OS-微凝胶至缺损底部，再注射CH-微凝胶，最后用纤维蛋白胶封固）。术后观察发现，实验组犬只步态恢复最佳。术后3个月和6个月，通过磁共振成像（MRI）评估，实验组显示出更连续、均匀的修复组织信号，软骨下骨水肿消退更明显，WORMS评分显著优于其他两组。大体观察显示，实验组在6个月时缺损被修复组织完全填充，表面光滑有光泽，与周围正常软骨整合良好，国际软骨修复学会（ICRS）宏观评分最高。组织学染色（H&E、番红O/固绿、Masson）结果进一步证实：空白对照组主要为纤维组织填充；对照组虽有部分软骨样组织形成，但软骨层薄且软骨下骨结构紊乱；而实验组则成功再生出了层次清晰的结构，包括表面光滑的透明软骨样组织和结构良好的软骨下骨，且两层之间以及修复组织与宿主组织之间实现了良好整合。改良的O‘Driscoll组织学评分显示，实验组在各时间点的得分均显著高于其他组。这有力证明了，通过序贯注射两种预分化的定制化微凝胶，能够在缺损部位原位自组装成功能性的骨软骨类器官，并实现高质量的骨软骨一体化再生。

本研究得出的核心结论是：成功开发了一种利用功能定制化微低温凝胶构建自组装骨软骨类器官的新策略。该策略无需使用大块支架或外源性生长因子，仅通过材料本身的微环境调控，即可引导MSCs进行空间定向分化，并在体内外自组装成结构整合、功能分层的骨软骨单元。分子机制研究表明，定制化微凝胶通过差异调节PI3K-Akt、TGF-β和MAPK等关键信号通路，同时调控炎症/免疫反应，从而精确引导MSCs的软骨/成骨命运。在大型动物模型中，该方法成功实现了关节软骨和软骨下骨的同步、层次化再生，展示了其作为简单、有效、可注射的骨软骨修复解决方案的巨大潜力。

本研究的亮点和创新性在于：1. 方法学创新：首次将“定制化微凝胶”与“自组装类器官”概念相结合，用于骨软骨再生，提供了一种全新的、无需生长因子的组织构建策略。2. 材料设计巧妙：利用HA和Hyp这两种生物活性成分对微凝胶进行功能化，物理化学性质（如密度、模量）和生物学功能（诱导分化、促血管化）的差异化设计，为实现空间分区和原位自组装奠定了基础。3. 机制探索深入：通过mRNA-seq深入揭示了材料调控细胞命运的分子通路图谱，不仅解释了“如何起作用”，也为未来进一步优化材料提供了理论靶点。4. 转化潜力显著：所采用的微凝胶具有可注射性、便于储存和操作，且在大动物模型中取得了优异的修复效果，向临床转化迈进了一步。

此外，研究也坦诚地指出了其局限性，包括：未对鉴别的分子机制进行逐一深入验证；动物实验样本量相对较小，观察时间尚不足以证明完全修复；所用为急性损伤模型，未在慢性或骨关节炎背景下测试；以及尚未与当前临床主流疗法进行头对头比较。这些均为未来的研究方向指明了道路。这项研究为界面组织工程（如骨软骨、肌腱-骨等）的再生提供了一种极具前景的新范式。