学术研究报告

一、 作者与发表信息

本研究由 Briana Spruill-Harrell, Alejandro Ponce-Flores, Evans Ifebuche Nnamani, Robert D. Owen, Michael A. Whitt 和 Colleen B. Jonsson 共同完成。主要作者机构包括美国田纳西大学健康科学中心的医学微生物、免疫与生物化学系、区域生物安全实验室、药学院制药科学系以及宿主-病原系统研究所，以及巴拉圭的科研发展中心和亚松森国立大学。通讯作者为 Colleen B. Jonsson。该研究于 2026 年 1 月 20 日发表于 PLOS Pathogens 期刊 (卷 22, 期 1)，文章编号 e1013839。

二、 学术背景

本研究属于病毒学与进化生物学交叉领域，重点关注病原体在自然宿主种群中的演化动态。研究的核心对象是朱奎提巴病毒 (Juquitiba virus, JUQV)，这是一种沙粒病毒科汉坦病毒属的正汉坦病毒 (Orthohantavirus)。JUQV 的天然宿主是黑足侏鼠 (Oligoryzomys nigripes)，主要分布于南美洲大西洋沿岸森林。该病毒可通过感染鼠类的唾液或排泄物传播给人类，导致汉坦病毒肺综合征 (Hantavirus Pulmonary Syndrome, HPS)，一种具有潜在致命性的呼吸道疾病。

尽管汉坦病毒的流行病学已被广泛研究，但其在自然宿主种群内维持、进化及传播的分子机制和驱动力尚不十分明确。此前的研究，包括本研究团队在巴拉圭 Mbaracayú 生物圈保护区的工作，并未发现气候、微生境或栖息地干扰等外部生态因素对当地宿主种群中 JUQV 流行率的显著影响。这促使研究者将目光转向病毒与宿主的内部相互作用。然而，由于野外样本中病毒 RNA 载量通常较低，传统的测序方法难以获得高质量的完整基因组数据，从而限制了对病毒种群遗传多样性进行深入分析的能力。

因此，本研究旨在通过开发和优化一种基于扩增子的高通量测序 (Next-Generation Sequencing, NGS) 技术平台，克服上述技术瓶颈，首次对野生黑足侏鼠种群中 JUQV 的遗传多样性进行系统性、全基因组水平的评估。具体目标包括：1) 获得 JUQV 在巴拉圭 Mbaracayú 地区的首个完整参考基因组；2) 揭示 JUQV 在不同组织、唾液和尿液中的遗传多样性模式；3) 探究驱动 JUQV 在宿主内和宿主间进化的主要力量（如选择压力）；4) 分析病毒遗传变异与宿主感染状态（急性或持续感染）及地理分布之间的关系。

三、 详细工作流程

本研究是一个多步骤的系统性研究，主要流程包括样本收集与处理、高通量测序技术平台的建立与优化、生物信息学分析与功能验证。

第一步：样本收集与初步筛选。 研究样本来源于 2014 年至 2017 年间在巴拉圭 Mbaracayú 生物圈保护区内的六个样地捕获的黑足侏鼠及其他啮齿类动物。共收集了 98 只 Oligoryzomys 属鼠类的肺组织样本，以及部分个体的唾液、尿液、心脏、肝脏、肾脏和脾脏样本。在采集后，所有样本均立即在液氮中速冻，并随后储存于-80°C，以保证 RNA 完整性。研究团队首先利用之前已建立的免疫荧光抗体检测 (IFA) 和巢式 RT-PCR 技术，对这些样本进行了 JUQV 感染状态（抗体阳性或 RNA 阳性）的初步筛查和分类。

第二步：NGS 测序平台的建立与参考基因组获取。 为了克服传统方法无法从低载量样本中获得高质量全长基因组的难题，本研究开发并优化了一套靶向扩增子测序流程。首先，研究者选择一只 JUQV 检测阳性的黑足侏鼠 (编号 TK184992) 的肺组织作为起点，设计了覆盖 JUQV S、M 和 L 三个基因组节段的特异性引物池。通过对该样本进行反复测试和优化，最终成功获得了 JUQV 的 S-节段 (1,902 bp，编码核衣壳蛋白 N)、M-节段 (3,675 bp，编码糖蛋白前体 GP) 和 L-节段 (6,564 bp，编码 RNA 依赖的 RNA 聚合酶) 的完整基因组序列。这构成了本次研究的参考基因组，其序列已提交至 GenBank。

第三步：大规模样本的 NGS 筛查与数据生成。 利用上述建立的 NGS 平台，研究者对来自 33 只感染 JUQV 的 Oligoryzomys 属鼠类（32 只 O. nigripes 和 1 只 O. mattogrossae）的多种样本进行了深度测序。筛选标准设定为：比对到参考基因组特定区域的读数超过 1,000 条，且覆盖长度大于 500 bp。最终，从肺组织获得了 17 个覆盖度 94–100% 的 S 和 M 节段病毒 RNA (vRNA) 基因组；此外，还从唾液、尿液、肺、心、肾、肝和脾等样本中获得了 101 个覆盖度≥80%、测序深度≥500倍的 vRNA 数据。所有高质量的共识序列（共 135 条 S 和 M 节段序列）均已存入 GenBank。

第四步：生物信息学与系统进化分析。 获得测序数据后，研究团队进行了全面的生物信息学分析，主要包括： 1. 系统发育与谱系地理学分析： 使用 MAFFT 进行多序列比对，IQ-TREE 2 构建基于最大似然法的系统发育树，并结合捕获地点坐标，分析 JUQV 在巴拉圭 Mbaracayú 种群内部的遗传结构，以及与来自巴西的 JUQV 和 Araucaria 病毒 (ARAV) 等南美汉坦病毒的亲缘关系。 2. 遗传多样性量化： * 香农熵计算： 对每个样本在 S 和 M 节段每个核苷酸位置的等位基因频率进行计算，生成香农熵值。通过热图和层次聚类分析，比较不同组织/体液样本（肺、唾液、尿液、心、肝、脾、肾）的遗传多样性模式。 * 单核苷酸多态性分析： 以参考基因组 TK184992 为基准，识别并统计所有高质量样本中频率≥5%的 SNP。将多态性分为共识多态性（频率≥50%）和少数群体多态性（频率<50%），并分别统计其在 S 和 M 节段中的数量、分布及在样本间的共享情况。 * 突变频率计算： 统计每个样本编码区的 SNP 数量，换算为每千核苷酸或每百氨基酸的突变频率，比较不同样本类型以及不同感染状态（抗体阴性的急性感染 vs 抗体阳性的持续感染）宿主间的差异。 3. 选择压力分析： 使用 Datamonkey 服务器上的固定效应似然法 (Fixed Effects Likelihood, FEL)，对来自肺组织的共识序列进行分析，评估 N 蛋白和 GP 的每个密码子位点是否受到正向选择或纯化选择（负选择）的压力。

第五步：功能验证实验。 为了探究选择压力分析中发现的潜在重要氨基酸突变的功能意义，研究者选取了 M 节段糖蛋白 Gn 上两个受到显著纯化选择的非同义突变位点 (Q292H 和 V504I) 进行功能验证。 1. 假型病毒构建： 将含有野生型 (WT) JUQV GP、Q292H 突变或 V504I 突变的质粒转染 HEK-293T 细胞，随后用缺失包膜糖蛋白 G 但携带 GFP 报告基因的 VSV (VSV∆G-GFP) 进行感染，从而产生包装有不同 JUQV GP 的假型病毒颗粒。 2. 病毒进入效率检测： 将假型病毒以系列稀释度感染 Vero E6 细胞。24 小时后，使用 Yokogawa CQ1 高内涵共聚焦显微镜自动采集图像，量化细胞内 GFP 阳性细胞（成功进入并表达 GFP）的比例。 3. 数据分析： 通过四参数逻辑回归拟合剂量-反应曲线，计算各假型病毒的半数有效浓度 (EC₅₀)，以此评估突变对病毒进入细胞效率的影响。

四、 主要研究结果

1. 系统发育揭示独特地理谱系： 系统进化分析表明，来自巴拉圭 Mbaracayú 保护区的 JUQV 序列形成了一个独立且具有高支持度的分支，与来自巴西的 JUQV 谱系显著不同。其遗传距离甚至与同域的 ARAV 更为接近。这表明尽管 JUQV 在南美大西洋森林广泛分布，但在不同地理区域已分化形成独特的进化谱系。

2. 组织特异性遗传多样性模式：

   • 香农熵分析显示，唾液和肺组织样本的遗传多样性最高，两者在聚类分析中也聚在一起。相比之下，肾脏、脾脏、肝脏和心脏样本的熵值较低，遗传多样性较为保守。尿液样本在多样性模式上更接近唾液。
   • SNP 分析进一步支持了这一发现。尽管不同样本类型间每千核苷酸的绝对突变频率无统计学差异，但唾液样本中独特的多态性位点比例更高，且少数群体变异的比例也显著高于肺和尿液，表明唾液中的病毒种群具有更丰富的亚共识多样性。

3. 感染状态影响核苷酸多样性： 比较急性感染（vRNA 阳性但抗体阴性）与持续感染（vRNA 和抗体均阳性）的宿主发现，持续感染个体的病毒基因组在核苷酸水平上具有显著更高的多样性。然而，这种增加的多样性主要是由同义突变驱动的，在氨基酸水平上并无显著差异。这表明在宿主免疫压力下，病毒通过积累不影响蛋白质功能的同义突变来维持较高的遗传变异储备。

4. 纯化选择是主要进化驱动力： FEL 选择压力分析表明，无论是在肺组织、唾液还是尿液的共识序列中，均未发现任何位点受到正向选择的证据。相反，在 N 蛋白和 GP 中分别鉴定出少量（N蛋白 8/352，GP 19/1133）受到显著纯化选择的密码子位点。这强烈提示，JUQV 在自然宿主种群中的进化主要受到功能约束，即有害突变被持续清除，有利于维持病毒蛋白的关键功能。

5. 关键突变影响病毒进入功能： 功能验证实验显示，Gn 上的 V504I 突变导致假型病毒进入 Vero E6 细胞的效率显著降低（EC₅₀ 约为野生型的一半），而 Q292H 突变则对进入效率无显著影响。这为纯化选择压力提供了功能层面的解释：V504I 突变可能损害了糖蛋白的功能（该位点位于预测的跨膜区附近），因此在自然种群中被选择性清除。通过 AlphaFold2 结构建模，发现 Q292H 位于融合环附近的关键区域，而 V504I 位于预测的跨膜区，与功能结果相互印证。

6. 病毒在宿主体内广泛分布且种群相对稳定： 对同一宿主不同组织（肺、心、脾、肾、唾液）的高质量共识序列进行网络分析发现，大多数个体内部，不同组织来源的病毒共识序列差异极小（个 SNP）。这表明病毒在宿主体内呈系统性感染，且在不同组织间传播的瓶颈效应较小，种群相对均一。少数例外个体表现出较大的组织间差异，但主要仍为同义突变。

7. 跨物种溢出的证据： 在一只 O. mattogrossae 个体中检测到了 JUQV 的 vRNA。其病毒序列与同区域捕获的黑足侏鼠（主要宿主）的病毒序列紧密聚类，提示这是一次从主要宿主向共生鼠种的溢出感染事件。

五、 结论与价值

本研究通过创新性地开发并应用一套高效的 NGS 测序流程，首次对野生黑足侏鼠种群中 JUQV 的遗传多样性、进化动力和传播模式进行了全面而深入的解析。主要结论是：在 Mbaracayú 保护区高度生物多样性的连续森林生境中，纯化选择是限制 JUQV 进化的主导力量。病毒的遗传多样性表现出明显的组织特异性（唾液和肺最高），并在持续感染阶段积累了更高的核苷酸（主要是同义）多样性。尽管存在地理谱系分化，但病毒在宿主种群内部的进化主要受制于维持基本功能（如细胞进入）的选择压力，而非适应性进化。

科学价值： 1. 方法论贡献： 建立了一套适用于低载量野外样本的正汉坦病毒全基因组深度测序流程，为未来类似研究提供了可靠的技术范本。 2. 理论认知深化： 挑战了外部生态因素为主导驱动力的传统观点，强调了宿主-病毒内部相互作用（如免疫压力下的纯化选择和组织微环境）在病毒进化中的核心作用。揭示了病毒在“高遗传多样性”与“强功能约束”之间的平衡策略。 3. 为风险评估提供依据： 明确了 JUQV 在主要宿主种群中的进化模式以稳定性为主，这有助于理解其溢出风险。跨物种感染个例的发现提示需要关注病毒在共生鼠种间的动态。

应用价值： 1. 公共卫生意义： 加深了对 HPS 病原体在自然疫源地维持机制的理解，为预测和防控疫情提供了分子流行病学基础。 2. 病毒进化研究范例： 为研究其他宿主-病原体共进化系统，特别是 RNA 病毒在自然种群中的演化，提供了一个详尽的研究案例。

六、 研究亮点

1. 技术新颖性： 成功开发并优化了针对低病毒载量野外样本的汉坦病毒全基因组 NGS 测序方案，解决了该领域长期面临的技术瓶颈。
2. 研究系统性： 罕见地同时对同一批野外个体的多种组织（包括排泄物）进行了高通量测序和比较分析，提供了病毒在宿主体内分布和多样性的全景视图。
3. 发现重要性： 明确了纯化选择作为 JUQV 在自然宿主种群中进化的主要力量，并首次通过功能实验验证了纯化选择位点的生物学意义（V504I 突变降低感染性）。
4. 数据开放性： 研究产生的所有 NGS 原始数据和共识序列均已公开存入公共数据库 (Bioproject PRJNA1329225, GenBank)，具有很高的可重复性和再利用价值。

七、 其他有价值内容

研究还指出了当前南美汉坦病毒基因组数据，特别是完整基因组数据的匮乏，限制了对其进化历史的精确重建。本研究获得的 JUQV 完整基因组是该病毒株系中为数不多的全基因组数据之一，将极大地促进未来对南美汉坦病毒系统发育、重组事件和跨物种传播能力的深入研究。此外，研究者提出，尽管病毒在种群层面呈现稳定进化，但唾液和肺中较高的遗传多样性“热点”可能蕴含着与传播或组织嗜性相关的适应性潜力，值得未来进一步探究其机制。