本研究的通讯作者为 Sachita Shrikant Naik，所属机构为印度卡纳塔克邦贝尔高姆市的 Maratha Mandal’s Nathajirao G. Halgekar 牙科学与研究中心 (Maratha Mandal’s Nathajirao G. Halgekar Institute of Dental Sciences and Research Centre, Belgaum, Karnataka, India)。研究团队还包括 Vijayalakshmi Sharadindu Kotrashetti, Kishore Gajanan Bhat 和 Vijay Mahadev Kumbar。该研究发表于期刊《Journal of Indian Society of Periodontology》（J Indian Soc Periodontol）2024年第28卷第4期（7-8月刊），于2025年1月6日正式在线发表。

学术背景 本研究隶属于口腔微生物学与牙周病学交叉领域。研究聚焦于口腔正常菌群成员——普雷沃菌属（*Prevotella*），特别是中间普雷沃菌（Prevotella intermedia, Pi）和变黑普雷沃菌（Prevotella nigrescens, Pn）在慢性牙周炎（Chronic Periodontitis, CP）发生发展中的作用。这两种细菌均为黑色素沉淀、糖分解、厌氧的革兰氏阴性杆菌，过去被认为是同一菌种的不同基因型，在表型上难以区分，通常需要依赖分子生物学技术进行鉴别。尽管以往研究表明Pi可能与牙周炎病损部位相关，而Pn则更常见于健康牙龈，但为了准确评估这两种菌在健康和疾病状态下的真实丰度与作用，需要一种在常规实验室环境中可行、经济且快速的检测方法。

目前，用于分离和鉴定Pi和Pn的分子技术（如各种聚合酶链式反应PCR技术、限制性内切酶分析等）通常需要昂贵的专业设备或操作条件苛刻，难以在标准实验室推广。而荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）虽然有效，但需要荧光显微镜。相比之下，显色原位杂交（Chromogenic in situ hybridization, CISH）技术具有明显优势：它使用比对的寡核苷酸探针与靶微生物的特定核酸序列结合，并通过酶联显色反应（如链霉亲和素-生物素化辣根过氧化物酶复合物与DAB底物）产生肉眼或普通光学显微镜下可见的棕色沉淀，从而实现对目标微生物的直接观察、鉴定和定量。该技术操作相对简单、耗时少、成本较低，且仅需普通光学显微镜。然而，CISH技术在口腔微生物，特别是Pi和Pn的鉴定与定量中的应用，在英文文献中鲜有报道。

因此，本研究旨在填补这一方法学和应用上的空白。其主要目标是通过CISH技术，从慢性牙周炎患者和牙周健康个体的龈下菌斑样本中，分离、鉴定并量化Pi和Pn，评估CISH作为一种诊断工具的效能，并进一步阐明这两种细菌与牙周健康状况之间的关系。

详细工作流程 本研究是一项横断面观察性研究，其工作流程主要包括受试者纳入与临床检查、样本采集与处理、细菌培养（作为传统方法的对照）、CISH检测以及数据统计分析五个核心部分。

第一，受试者纳入与临床检查。 研究共纳入100名年龄在20-70岁的受试者，分为人数相等的两组：50名慢性牙周炎（CP）患者和50名牙周健康个体。样本量通过G*Power软件计算确定。研究获得了机构伦理审查委员会的批准，所有受试者均签署知情同意书。牙周健康的纳入标准包括：探诊深度≤3 mm、无临床炎症迹象（通过牙龈指数评估）、无临床附着丧失、无牙齿松动。CP组的纳入标准为：在4颗或以上牙齿存在≥3 mm的临床附着丧失，探诊出血，且在4颗或以上牙齿的探诊深度≥5 mm。排除标准包括：患有任何系统性疾病的患者、过去3个月内接受过牙周治疗或服用过抗生素/抗菌药物者、孕妇及哺乳期妇女、以及吸烟或使用无烟烟草者。对所有受试者进行了全面的临床检查，记录菌斑指数（Silness和Loe）、牙龈指数（Loe和Silness）、探诊深度和临床附着丧失。对于CP患者，根据探诊深度和附着丧失程度，将牙周炎严重程度分为轻度（1-2 mm）、中度（3-4 mm）和重度（≥5 mm）。

第二，样本采集与处理。 在去除龈上菌斑后，使用无菌Gracey刮治器采集龈下菌斑样本。健康组从至少四颗牙齿采集，CP组则从四个最深牙周袋或病变最严重的部位采集。采集的样本立即转移至还原运输液（reduced transport media）中，并送至实验室进行处理。每个样本被分成两份，一份用于传统的细菌培养，另一份用于CISH检测。

第三，细菌培养（对照方法）。 将样本接种于含有氯化血红素和维生素K的血琼脂平板以及卡那霉素血琼脂平板上。然后将平板置于厌氧罐中，在37°C条件下培养48-72小时。观察可疑菌落特征（如色素沉着），进行革兰染色确认是否为革兰阴性杆菌，并通过生化试验鉴定Pi和Pn。

第四，显色原位杂交（CISH）检测。 这是本研究应用的核心创新性方法。其具体步骤如下： 1. 样本制备与固定：样本以300 rpm转速离心5分钟，弃去上清液，取15-30 µL沉淀物用4%多聚甲醛溶液固定。在洁净干燥的明胶包被载玻片上制作菌斑涂片，于46°C干燥5分钟。 2. 脱水：将载玻片依次通过不同浓度的酒精（50%、80%、96%）各3分钟进行脱水，随后在45°C干燥10分钟。 3. 探针杂交：准备针对Pi和Pn的特异性寡核苷酸探针溶液（探针序列见表1）。将探针与杂交缓冲液混合后，滴加至载玻片上，置于湿盒中，在46°C的烤箱内孵育4小时，使探针与细菌靶核酸序列特异性结合。 4. 洗脱：将载玻片置于洗涤缓冲液中，然后在48°C水浴中孵育10-15分钟，以洗去未结合的探针。 5. 信号检测：按照制造商说明书，以1:500的稀释度配制链霉亲和素-生物素化辣根过氧化物酶复合物溶液，滴加至载玻片上，孵育45分钟。随后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤。 6. 显色与复染：加入二氨基联苯胺（DAB）工作液，孵育15分钟，DAB在过氧化物酶催化下产生不溶性的棕色沉淀。用PBS洗涤后，用吉姆萨染液进行复染，再用蒸馏水清洗，最后用DPX封片剂封片。 7. 镜检与定量分析：在×100放大倍率的双目光学显微镜下观察载玻片。若观察到深棕色杆状菌体（背景为蓝色），则判读为阳性。定量评分标准如下：0分=阴性；1分=1-10个细菌；2分=10-100个细菌；3分=>100个细菌；4分=成团聚集。

第五，数据统计分析。 使用SPSS 14.0软件进行统计分析。采用的统计检验包括Fisher精确检验、Mann-Whitney U检验、Pearson卡方检验和Spearman’s rho相关检验。P值<0.01被认为具有统计学显著性。研究比较了健康组与CP组之间不同普雷沃菌株的检出率，以及细菌定量评分与临床指标（牙龈指数、菌斑指数、牙周评分）之间的相关性。

主要研究结果 1. 受试者基本特征与临床指标： 100名受试者中，女性56名，男性44名。CP组年龄范围（30-67岁）高于健康组（23-43岁）。比较两组间的平均牙龈指数、菌斑指数和牙周评分，CP组的均值均略高于健康组，但这些差异在统计学上均不显著（P值分别为0.75， 0.37， 0.07 for Pi correlation; 0.79， 0.77， 0.30 for Pn correlation）。

2. CISH与培养法的比较： CISH技术的敏感性显著高于传统的培养法。在CP组中，针对Pi和Pn，CISH的阳性检出率为54%（27/50），而培养法的阳性检出率仅为24%（12/50），差异具有高度统计学意义（P=0.002）。在健康组中也观察到类似的趋势（Pi/Pn CISH阳性46%/66% vs. 培养阳性14%/14%， P=0.000）。这表明传统培养法严重低估了样本中普雷沃菌的丰度，而CISH能更灵敏地检测出这些微生物。

3. Pi和Pn在健康与CP组中的分布与定量： * 中间普雷沃菌（Pi）： 在CP组中的阳性病例数（54%）略高于健康组（46%）。当对检出的细菌进行定量评分比较时，CP组的平均评分（0.85±1.08）高于健康组（0.50±0.70），尽管这一差异未达到设定的显著性水平（P=0.153）。 * 变黑普雷沃菌（Pn）： 与Pi相反，Pn在健康组中的阳性病例数（66%）高于CP组（54%）。定量评分显示，健康组的平均评分（0.72±0.78）略高于CP组（0.58±0.72），差异同样不显著（P=0.239）。值得注意的是，健康组中有一例样本出现了细菌成团（评分4）的情况。

4. 细菌数量与牙周炎严重程度的关系： 随着牙周炎严重程度的增加，Pi和Pn的阳性病例百分比均呈上升趋势。例如，对于Pi，在轻度、中度和重度牙周炎组中，阳性病例占比分别为66.7%（6/9）、62.5%（10/16）和44.0%（11/25）；对于Pn，这一比例分别为44.4%（4/9）、43.8%（7/16）和64.0%（16/25）。这一结果表明，两种细菌的丰度都可能与牙周组织的破坏程度存在关联。

5. CISH技术作为诊断工具的效能： 本研究成功地将CISH技术应用于口腔龈下菌斑样本中Pi和Pn的鉴定。在光学显微镜下，可以清晰地观察到被染成深棕色的目标杆菌（如图1所示），实现了在单细胞水平上对特定微生物的准确识别和半定量分析。

结论 本研究得出以下结论： 1. 方法学意义： 与传统的金标准培养法相比，显色原位杂交（CISH）技术是一种更简单、快速、准确的口腔细菌鉴定方法。它不需要高端复杂的设备，可以在常规实验室环境中开展，为快速诊断牙周病原菌提供了一种有前景的新工具。 2. 微生物学意义： 通过CISH技术定量分析发现，与变黑普雷沃菌（Pn）相比，中间普雷沃菌（Pi）在慢性牙周炎（CP）患者中的检出率和数量趋势更高，而在健康受试者中Pn的评分更高。这支持了先前的研究观点，即Pi更倾向于与牙周病损相关，而Pn在健康龈下环境中的存在更为普遍。因此，Pi可能是牙周炎的协同致病因素之一。 3. 临床价值： 快速、准确地评估牙周病损部位的病原微生物组成，对于疾病的诊断和治疗计划制定至关重要。CISH技术能够直接处理菌斑样本，在4-5小时内完成检测，有助于实现更精准的诊断和预后判断。

研究亮点 1. 方法创新： 本研究首次系统地将显色原位杂交（CISH）技术应用于口腔龈下菌斑样本中两种重要普雷沃菌（Pi和Pn）的同步鉴定与定量分析，填补了该方法在口腔微生物诊断应用领域的空白。 2. 技术优势验证： 研究直接对比了CISH与传统培养法的检出率，有力证明了CISH在检测这类难以培养或表型相似的厌氧菌方面具有更高的敏感性。 3. 应用导向明确： 研究强调了CISH技术经济、快速、设备要求低的特点，突出了其在基层或临床实验室推广用于牙周病原菌快速诊断的潜力，具有明确的转化医学价值。 4. 深化对病原菌的认识： 研究不仅关注了细菌的“有无”（检出率），还通过半定量评分系统分析了其在健康和疾病状态下的“多少”（相对丰度），并从严重程度分层的角度分析了其与疾病进展的关系，提供了更细致的微生物学数据。

其他有价值的内容 研究也指出了当前CISH技术应用的局限性：该技术操作步骤较为精细，需要一定的专业经验；此外，菌斑样本中存在的蛋白质物质有时可能导致背景染色，干扰对目标微生物的判读。未来的研究需要进一步优化和标准化该技术以克服这些障碍。同时，作者建议未来应扩大研究范围，利用CISH技术探索普雷沃菌属其他菌种与牙周健康及疾病的关系，以更全面地理解该属细菌在牙周生态和疾病进程中的作用。该研究由Rajiv Gandhi健康科学大学资助完成。