甲状腺激素受体β（thrb1）是人诱导多能干细胞来源肝细胞中T3作用的主要调节因子

主要作者：Lorraine Soares de Oliveira、Joseph E. Kaserman、Anne H. van der Spek、Nora J. Lee、Hendrik J. Undeutsch、Rhiannon B. Werder、Andrew A. Wilson、Anthony N. Hollenberg

主要研究机构：Boston University Chobanian & Avedisian School of Medicine（波士顿大学乔巴尼安与阿维迪西安医学院）、Boston Medical Center（波士顿医学中心）、Center for Regenerative Medicine of Boston University and Boston Medical Center（波士顿大学与波士顿医学中心再生医学中心）、Amsterdam UMC（阿姆斯特丹大学医学中心）、Weill Cornell Medicine（威尔康奈尔医学院）

发表期刊与时间：Molecular Metabolism，第90卷，2024年（文章编号102057），2024年10月24日接收，2024年10月29日在线发表。

一、研究背景

甲状腺激素（thyroid hormone, TH）对机体正常发育和成体生理功能维持至关重要。甲状腺激素的作用主要由核受体甲状腺激素受体α（thra）和甲状腺激素受体β（thrb）介导，其中三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine, T3）是主要的活性配体。在肝脏中，thrb1被认为是主要表达的甲状腺激素受体亚型。在T3缺乏时，甲状腺激素受体可招募核受体辅抑制因子复合物（包括ncor1和smrt）介导基因转录抑制；随着T3浓度升高，辅抑制因子复合物被释放，转而招募辅激活因子复合物，促进T3靶基因表达。

既往小鼠模型研究已证实，T3主要通过thrb1调节肝脏多条代谢通路，包括脂肪酸合成、β-氧化、脂解、糖异生和胆汁酸合成等。然而，由于缺乏能够忠实再现人类肝细胞中甲状腺激素信号通路的体外模型系统，人类肝细胞中甲状腺激素信号调控上述代谢通路的分子机制至今仍不明确。近年来，人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）技术结合CRISPR/Cas9基因编辑，为在人类细胞中研究甲状腺激素信号提供了新平台。本研究组此前已证实人iPSC来源肝细胞（iPSC-derived hepatocytes, iHeps）对T3高度响应，且可能依赖thrb1调控数百个靶基因。因此，本研究拟利用CRISPR/Cas9技术在iPSC中敲除thrb1，建立thrb1敲除（thrbko）iHeps模型，系统阐明thrb1在人类肝细胞中的配体非依赖性和配体依赖性功能，以及thra在其中的潜在代偿作用。

二、研究方法与流程

本研究主要包括以下实验流程：

第一，thrb1敲除iPSC系的建立与鉴定。研究使用BU3-10-CR2人iPSC系，设计了两条靶向thrb基因第8号外显子两侧内含子区域的引导RNA（guide RNA, gRNA），利用CRISPR/Cas9技术切除约1.5 kb的片段，该片段包含部分DNA结合域和配体结合域编码序列，从而实现对thrb1亚型的截断性敲除。gRNA与Cas9和GFP编码序列克隆于同一质粒中。经PCR筛选和Sanger测序确认双等位基因正确靶向的克隆被选定为thrbko iPSC系；野生型（wild type, WT）iPSC作为同基因对照。敲除效率通过RT-qPCR在iPSC和iHeps阶段验证，结果显示thrbko细胞中thrb1 mRNA不可检出；thra表达在iPSC和iHeps中均无显著差异。

第二，iPSC向肝细胞定向分化。采用已发表的定向分化方案，iPSC经4天终末内胚层（definitive endoderm, DE）诱导，随后经肝祖细胞阶段逐步分化为肝细胞样细胞，全程约25天。分化第5天通过流式细胞术检测ckit和cxcr4双阳性细胞评估内胚层效率；第25天检测afp和foxa1评估肝细胞标志物表达。

第三，T3刺激实验与基因表达谱分析。在分化第24天，WT和thrbko iHeps分别接受PBS（载体对照）、1 nM、10 nM及100 nM T3处理24小时。随后收集RNA进行RT-qPCR和bulk RNA测序（RNA-seq）。RNA-seq利用Illumina NovaSeq 6000平台进行，数据比对至人类参考基因组GRCh38，使用edgeR包进行差异表达分析，fgsea包进行富集分析。数据已上传至NCBI GEO（编号GSE270233）。

第四，增殖能力检测。采用Click-iT EdU掺入实验结合流式细胞术，在分化第0天（iPSC未分化态）、第11天（肝祖细胞）和第25天（肝细胞）三个时间点评估细胞周期S期比例。同时通过RT-qPCR检测增殖标志基因mki67、ccnd1和抗增殖基因btg2的表达。

第五，糖异生功能检测。iHeps先在不含血清的“洗脱培养基”中培养24小时以消除Akt活化干扰，再以100 nM T3或PBS处理24小时。随后在无葡萄糖、无谷氨酰胺、无酚红的DMEM中添加10 mM L-乳酸和1 mM丙酮酸钠培养5小时，检测上清中葡萄糖生成量，并用总蛋白含量校正。

第六，脂质代谢分析。通过油红O染色观察和定量iHeps中脂滴堆积。在基础状态以及油酸（oleic acid, OA）和棕榈酸（palmitic acid, PA）以2：1比例（OA 0.66 mM，PA 0.33 mM）联合游离脂肪酸-BSA复合物刺激24小时后，分别检测脂滴含量。同时用RT-qPCR检测脂肪合成相关基因（mlxipl、fasn、acaca、elovl6）、脂肪酸氧化相关基因（ppard、cpt1a）、胆固醇代谢相关基因（lipc）以及脂肪酸转运相关基因（cd36、fabp1）的表达。

第七，thra功能验证。为区分thrb和thra对特定靶基因的作用，使用thrb选择性激动剂GC-1（sobetirome）。WT和thrbko iHeps分别接受T3（1 nM、10 nM）或GC-1（0.25 nM、0.5 nM、1 nM）处理24小时，通过RT-qPCR检测thrb专属靶基因（pck1、g6pc、fbp1）以及潜在thra靶基因（klf9、coq10a、elovl2）的表达变化。

三、主要研究结果

首先，thrb1敲除不影响肝细胞定向分化。流式细胞术显示WT和thrbko细胞在第5天内胚层标志物ckit/cxcr4阳性率以及第25天肝细胞标志物afp/foxa1阳性率均无显著差异；RT-qPCR也显示白蛋白（alb）、afp、serpina1、ttr和hnf4等肝细胞标志基因表达未受影响；免疫荧光染色证实两者均可表达白蛋白和hnf4a蛋白。这些结果表明thrb1对iHeps的谱系特化并非必需。

其次，thrb1调节iPSC和早期肝系细胞的增殖。在未分化iPSC阶段（第0天），thrbko细胞EdU掺入率显著低于WT细胞，S期细胞比例减少；抗增殖基因btg2在thrbko iPSC中表达升高。在第11天肝祖细胞阶段，thrbko细胞仍表现为增殖能力降低，ccnd1和btg2表达均下调。到第25天肝细胞阶段，两种细胞均基本退出细胞周期，EdU掺入极低；但thrbko iHeps中mki67表达反而升高。这些数据提示thrb1在肝细胞分化早期阶段具有促进增殖的作用。

RNA-seq分析揭示了thrb1在iHeps中的全局转录调控作用。主成分分析显示，WT细胞在有无T3处理时形成明显分离的聚类，而thrbko细胞在T3处理后不能形成独立聚类；此外，在无T3条件下WT和thrbko细胞也分别聚类，提示未配体结合的thrb具有转录调控功能。差异表达分析发现，WT iHeps中有951个基因被T3上调、445个基因被下调；而thrbko iHeps中仅9个基因被上调、3个基因被下调。同时，与WT相比，thrbko iHeps在无T3状态下有279个基因上调、218个基因下调，进一步支持thrb1具有配体非依赖性转录调控作用。值得注意的是，即使缺乏thrb，仍有少数基因如klf9、coq10a和egr1对T3保持响应。

在糖代谢方面，T3可显著上调WT iHeps中葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基（g6pc）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（pck1）的表达，同时下调果糖-1，6-二磷酸酶1（fbp1）；但所有这些效应在thrbko细胞中均消失。与此一致，WT iHeps在T3刺激后葡萄糖生成量显著增加，而thrbko iHeps则完全丧失该反应。这些结果证明T3对肝细胞糖异生的调控依赖于thrb1。

在脂质代谢方面，显微镜下观察到thrbko iHeps中存在大量细胞内脂滴。油红O染色定量证实，thrbko iHeps在基础状态下脂滴堆积显著高于WT细胞，且不受T3处理影响。脂肪酸负荷实验（OA+PA）导致两种细胞脂滴进一步增加，但thrbko细胞堆积更为显著。基因表达分析显示，T3通过thrb1依赖的方式上调脂肪合成基因mlxipl、fasn、acaca和elovl6，以及脂肪酸氧化相关基因ppard和cpt1a、胆固醇代谢相关基因lipc和脂肪酸转运相关基因cd36。与这些变化不同，fabp1在thrbko细胞中表达上调，提示其可能通过增加脂肪酸转运而促进脂质堆积。

最后，thra在部分基因调控中发挥代偿作用。RT-qPCR验证了RNA-seq结果，证实coq10a、egr1、trpm6在T3处理后在WT和thrbko iHeps中均上调，而hmgcs2、elovl2和clk1均下调。利用thrb选择性激动剂GC-1发现，pck1、g6pc和fbp1在WT细胞中对GC-1和T3均有响应，但在thrbko细胞中对两者均无反应；而klf9、coq10a和elovl2在WT细胞中对T3和GC-1均有响应，但在thrbko细胞中仅对T3响应而不对GC-1响应。这表明这些基因在缺乏thrb时可由thra介导T3响应。

四、结论与意义

本研究首次在人类肝细胞中建立了thrb1敲除的iPSC来源肝细胞模型，系统证明了thrb1在人类肝细胞代谢调控中的核心地位。研究结论包括：第一，thrb1虽然对肝细胞分化不是必需的，但在iPSC和肝祖细胞增殖中发挥重要作用；第二，thrb1介导T3对糖异生和多种脂质代谢通路的调控，其缺失导致糖异生反应丧失和脂质堆积增加；第三，thrb1在人类肝细胞中同时具有配体依赖性和配体非依赖性转录调控功能；第四，部分T3靶基因在thrb缺失后仍保持响应，提示thra在人类肝细胞中具有独特的调控功能。

该研究的科学价值在于：填补了人类肝细胞甲状腺激素信号机制研究的空白，提供了可编辑的人类细胞平台用于解析thr亚型特异性功能。应用价值在于：鉴于近年thrb选择性激动剂已被批准用于治疗代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD），但仅约30%患者有响应，本研究建立的模型可用于深入研究thr类似物的作用差异和个体化治疗策略，并为未来开发新的代谢疾病干预手段提供重要工具。

五、研究亮点

本研究的突出亮点包括：第一，首次利用CRISPR/Cas9技术在人类iPSC中特异性敲除thrb1，并成功分化为功能性肝细胞，为研究人类肝脏甲状腺激素信号提供了独特的同基因对照模型；第二，通过RNA-seq结合功能实验，系统阐明了thrb1在人类肝细胞中的配体依赖性和非依赖性转录调控网络；第三，利用thrb选择性激动剂GC-1，首次在人类肝细胞中区分了thrb与thra对特定靶基因的差异调控，揭示了thra在肝脏中的潜在功能；第四，将基因表达分析、糖异生产量检测和脂质堆积定量等多种手段相结合，从转录到功能层面验证了thrb1的代谢调控作用。