本研究由Ksenija Romane（苏黎世联邦理工学院分子生物学与生物物理研究所）、Giulia Peteani（伯尔尼大学生物化学与分子医学研究所）、Somnath Mukherjee（芝加哥大学生物化学与分子生物学系）等多名学者合作完成，于2025年发表在《Nature Communications》期刊（DOI: 10.1038/s41467-025-64490-z）。研究聚焦于人类多药及毒素外排蛋白1（human Multidrug and Toxin Extrusion protein 1, hMATE1）的结构与功能机制，揭示了该转运体识别药物的分子基础。

学术背景

hMATE1属于SLC47A家族转运蛋白，在肾脏和肝脏的顶膜高表达，负责将包括抗糖尿病药物二甲双胍（metformin）在内的多种阳离子药物外排至尿液和胆汁中。其功能对药物清除率和疗效具有关键影响。尽管此前研究表明细菌MATE转运体的结构特征，但真核生物MATE（尤其是人类hMATE1）的底物识别机制尚不明确。本研究旨在通过冷冻电镜技术解析hMATE1与底物及抑制剂的复合物结构，阐明其底物结合位点特征及转运机制。

研究流程与方法

1. 蛋白表达与活性验证

研究团队首先在HEK293细胞中建立了可诱导表达hMATE1的稳定细胞系，并通过放射性标记的1-甲基-4-苯基吡啶鎓（[³H]-MPP⁺）摄取实验验证其转运活性。同时采用荧光染料DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）评估转运选择性。为增强冷冻电镜成像效果，研究人员开发了两种特异性合成抗体片段（Fab 3和Fab 6），其中Fab 6可抑制hMATE1的转运活性，而Fab 3无此效应。

2. 冷冻电镜结构解析

将hMATE1重构至纳米盘中以模拟天然脂质环境，分别与Fab 6或Fab 3结合后，采用冷冻电镜技术解析了以下结构： - apo状态：分辨率达2.95 Å（Fab 6复合物）和3.7 Å（Fab 3复合物），均显示外向开放构象。 - 底物/抑制剂复合物：以Fab 6为稳定剂，分别解析了hMATE1与二甲双胍（2.3 Å）、MPP⁺（3.1 Å）和西咪替丁（cimetidine，3.3 Å）的三维结构。所有复合物均保持外向开放构象，RMSD差异仅为0.3–0.4 Å。

3. 底物结合位点分析

结构分析发现： - 结合口袋位于hMATE1的C叶（C-lobe），具有负电性特征，由E273、E389、W274、Y277、Y299和Y306等残基构成。 - 二甲双胍：通过氨基与E273/E389形成库仑作用，并与Y277/Y306产生阳离子-π相互作用。分子动力学模拟显示其在口袋内具有高度灵活性。 - 西咪替丁：甲基咪唑环与Y277/Y306形成π-π堆积，氰基胍基与W274疏水作用。其抑制效力（IC50 = 2.7 μM）显著强于二甲双胍（IC50 = 58 μM）。 - MPP⁺：吡啶鎓环指向E389，芳环与W274/Y277形成π-π作用。

4. 功能验证实验

通过定点突变和放射性摄取实验验证关键残基功能： - 芳香族残基突变：Y277A完全丧失活性，Y277F部分恢复；Y299F增强MPP⁺摄取。 - 酸性残基突变：E273A/E389A导致转运功能完全丧失。 - 色氨酸突变：W274A显著降低所有底物的结合能力。

主要发现与结论

1. 结构机制：首次揭示真核MATE转运体的底物结合位点位于C叶，不同于细菌同源物的N叶定位。质子耦合转运可能通过E273/E389的构象变化实现。
2. 动态行为差异：底物与抑制剂的结合模式存在显著差异——西咪替丁通过刚性结合高效抑制，而二甲双胍则通过动态结合实现转运。
3. 药理意义：阐明了药物-药物相互作用（如西咪替丁抑制二甲双胍排泄）的结构基础，为临床用药组合设计提供指导。

研究亮点

• 技术创新：开发了Fab-纳米盘复合物冷冻电镜策略，克服了hMATE1分子量小（62 kDa）的成像难题。
• 跨学科方法：结合冷冻电镜、分子动力学模拟和功能实验，实现从结构到机制的完整解析。
• 临床相关性：直接解释了FDA/EMA推荐的hMATE1抑制评估的分子基础。

科学价值

本研究不仅填补了真核药物转运体结构研究的空白，还为优化药物代谢特性提供了精准的分子蓝图。通过揭示hMATE1的底物识别规律，可指导糖尿病、癌症等疾病的药物设计，减少不良药物相互作用。此外，建立的Fab辅助冷冻电镜技术为小分子量膜蛋白结构研究提供了新范式。