基于微流控技术的高通量、无基质、血管化并矿化骨类器官的构建与应用研究
第一， 研究团队、发表期刊与时间 本研究由大连医科大学口腔医学院的薛莉、张子娇（并列第一作者）、刘慧颖教授（通讯作者），以及中国科学院上海微系统与信息技术研究所传感技术国家重点实验室的田甜、陈晨、徐鑫、惠嘉楠教授（通讯作者）、毛红菊教授（通讯作者）等组成的跨学科团队共同完成。研究成果以题为《High-throughput microfluidic generation of self-assembled, uniform 3D vascularized and mineralized bone organoids without matrix biomaterials》的论文形式，发表于期刊 Talanta Open（卷12，文章ID 100531），在线发表日期为2025年8月15日。
第二， 学术背景与研究目的 本研究属于生物医学工程、组织工程和微流控技术交叉领域，聚焦于骨类器官的体外构建。骨类器官在模拟骨骼相关疾病、改进骨损伤修复策略以及高通量药物筛选方面具有巨大潜力。然而，传统的骨类器官构建方法严重依赖基质生物材料，如Matrigel、胶原凝胶或3D打印支架。这些材料存在成分不明确、批次间差异大、制造工艺复杂、成本高昂等问题，限制了其临床应用和标准化药物筛选。
研究背景基于几个关键认知：首先，当前骨药物筛选主要依赖于二维细胞培养和动物模型，难以模拟人体骨组织复杂的生理微环境。其次，美国FDA已不再强制要求新药审批必须进行动物实验，这加速了器官芯片技术在疾病模型研究中的应用。再者，骨骼是一个动态、多功能器官，其功能依赖于包括血管化在内的多种生理过程。血管网络对于营养和氧气的输送至关重要，血管化不足常导致骨类器官存活率低。因此，构建同时具备血管化和矿化潜能的骨类器官，对于实现准确的药物筛选至关重要。
本研究的核心目的是开发一种新型的、无需外源基质材料的高通量微流控平台，用于生成大小均一、自组装、兼具血管化和矿化功能的3D骨类器官，以克服传统方法的局限性，为骨组织工程、药物筛选和疾病建模提供一个更可靠、可重复且经济的工具。
第三， 详细研究流程与方法 本研究的工作流程主要包括微流控芯片的设计与制造、细胞共培养与类器官形成、细胞活力与增殖评估、血管内皮功能评价、成骨分化功能评价以及统计分析等多个环节。
1. 微流控芯片的制造： 研究团队设计并制造了一种双层结构的聚二甲基硅氧烷微流控芯片。上层包含六个独立的微通道。下层则通过高精度3D打印技术制作了包含540个U形微孔阵列的模具，并以此翻模得到PDMS下层。为了解决3D打印模具侧壁粗糙的问题，研究团队创新性地在微孔阵列表面涂覆了一层薄薄的PDMS预聚物，利用表面张力形成均匀的U形结构，从而光滑了侧壁。上下层对齐键合后，形成了具有六个通道、总计540个微孔的完整芯片。为防止细胞粘附，芯片表面用Pluronic F-127进行了处理。该芯片的设计允许细胞悬液通过层流被均匀地引入每个通道并沉降到微孔中，在重力作用下自发聚集形成球体，同时不同通道可进行独立实验，实现了高通量和可重复性。
2. 细胞培养与类器官生成： 研究使用人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞作为构建骨类器官的细胞来源。细胞以75% hBMSCs和25% HUVECs的比例混合，形成细胞密度为1×10^6 cells/mL的悬液。该比例基于前人研究，旨在优化内皮-间充质相互作用，促进血管网络形成。类器官使用hBMSCs和HUVECs生长培养基按3:1比例混合的杂交培养基进行培养。将细胞悬液接种到芯片的U形微孔中，每个类器官约由1000个细胞组成。为了验证矿化胶原对成骨分化的促进作用，实验设置了对照组和添加了矿化胶原的实验组。类器官在芯片中培养长达21天，其形成和形态在第1、3、5、7天通过显微镜进行监测。
3. 细胞活力与增殖分析： 通过CCK-8 assay在培养的第1、3、5、7天评估类器官的增殖情况。使用Calcein-AM/EthD-1活死细胞染色试剂盒在相同时间点评估细胞活力，并通过荧光显微镜观察。此外，为了可视化两种细胞在类器官中的空间分布和行为，分别用绿色和红色荧光细胞追踪剂标记hBMSCs和HUVECs，并在培养的第0至5天进行观察。
4. 血管内皮功能评价： 培养7天后，对类器官进行免疫荧光染色，检测血管内皮特异性标记物CD31和VE-cadherin的表达，以确认内皮细胞表型的维持和血管网络的形成潜力。同时，通过实时定量逆转录聚合酶链反应技术，定量分析血管生成相关基因的表达水平，包括血小板内皮细胞粘附分子-1、缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子。
5. 成骨分化功能评价： 在诱导成骨分化14天后，通过免疫荧光染色检测早期成骨标记物Runt相关转录因子2、晚期成骨标记物骨钙素和骨桥蛋白，以及细胞外基质蛋白I型胶原的表达。通过RT-qPCR定量分析成骨相关基因的表达水平，包括I型胶原、碱性磷酸酶、Runx2、OCN和骨形态发生蛋白-2。此外，通过碱性磷酸酶染色观察早期矿化，通过茜素红S染色观察晚期钙结节形成，以验证类器官的矿化能力。
6. 数据分析： 所有数据均以均值±标准差表示。多组比较采用单因素方差分析，随后进行Dunnett’s t3事后配对比较检验。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。
第四， 主要研究结果 1. 类器官的成功构建与表征： 研究成功在微流控芯片中生成了大小均匀的3D多细胞球体。细胞在接种后24小时内开始松散聚集，第3天形成致密稳定的球状结构。到第5-7天，对照组球体平均直径约为120微米，而添加了MC的实验组球体直径约为140微米，表明MC促进了细胞增殖。免疫荧光染色显示，HUVECs均匀分布在球体内，并表达了CD31，证实了内皮表型的维持。这些结果证明了该平台能够在无基质条件下自发形成大小均一、功能特异的3D类器官。
2. 优异的细胞活力与增殖： 活死染色显示，在整个7天的培养期内，类器官中绝大多数细胞为活细胞，死细胞极少，第7天所有组别的细胞活力均超过99%，证明了培养条件和生物材料的良好生物相容性。CCK-8增殖实验表明，添加MC的实验组在所有时间点都表现出比对照组更高的增殖速率。连续5天的细胞追踪成像显示，细胞分布均匀，形态良好，活性高，证实了细胞在3D环境下有效增殖并保持活力。
3. 稳定的血管内皮功能： 培养7天后，免疫荧光染色显示类器官内存在强烈的VE-cadherin和CD31信号，证实了内皮细胞的完整性和特异性。RT-qPCR结果显示，PECAM-1、HIF-1α和VEGF等血管生成标记基因在对照组和MC组之间的表达水平没有显著差异。这表明，在测试条件下，MC的添加并未干扰内皮标记物的持续表达，类器官保持了稳定的血管化潜力。
4. 显著增强的成骨分化与矿化能力： 免疫荧光染色证实，培养2周后，所有组别的类器官均表达了Runx2、OCN、OPN和Col-1等成骨标记蛋白，显示出显著的成骨分化。RT-qPCR定量分析显示，与对照组相比，MC组的Col-1、ALP、Runx2和OCN基因表达水平显著上调。其中，OCN的表达水平是对照组的14.4倍。BMP-2的表达在两组间无显著差异。这些数据表明，3D多细胞球体环境本身就能促进成骨分化，而MC的加入进一步强化了这一过程。碱性磷酸酶染色和茜素红S染色分别在第14天检测到了早期矿化酶活性和明显的钙沉积红色区域，从功能上证实了类器官具有成熟的成骨细胞特性，能够进行有效的矿化。
第五， 研究结论与价值 本研究成功开发了一种高通量微流控芯片平台，该平台利用物理限制的U形微孔阵列，无需Matrigel或支架材料，即可同步生成540个大小均一的骨类器官。这些类器官展现出良好的细胞活力、成骨分化能力和内皮功能，证明了该平台在模拟成骨和早期血管化方面的能力。特别是，矿化胶原的加入显著增强了类器官的成骨潜能。
该研究的科学价值在于：1）提出了一种全新的、无基质依赖的骨类器官构建策略，避免了传统基质材料带来的批次差异和复杂性问题，提高了实验的可重复性和标准化程度。2）将微流控技术与3D细胞球体培养相结合，实现了骨类器官的高通量、平行化制备，为大规模药物筛选和材料评估提供了可能。3）成功构建了同时具备血管化和矿化特征的骨类器官模型，更贴近体内真实的骨组织微环境，提高了体外模型的生理相关性。
其应用价值体现在：为骨组织工程提供了一种实用的工具，可用于：1）高通量药物筛选：评估治疗骨质疏松、骨关节炎等骨病药物的疗效和毒性。2）生物材料评估：快速测试新型骨修复材料的生物相容性和成骨诱导能力。3）疾病建模：构建病理性的骨类器官模型，用于研究骨相关疾病的机制。
第六， 研究亮点 1. 方法学创新：首创了无需任何外源基质生物材料（如Matrigel、水凝胶、支架）的高通量骨类器官生成平台，从根本上解决了材料批次差异和成本问题。 2. 集成化设计：将微流控芯片的精确流体控制与U形微孔阵列的物理限制相结合，实现了细胞的自发、均匀聚集，形成了大小高度均一的3D球体，通量高（单芯片540个），样品消耗低。 3. 功能完整性：首次在无基质的微流控平台上，仅通过hBMSCs和HUVECs的共培养，成功构建了同时具备显著成骨分化潜能和稳定血管内皮特征的骨类器官，模拟了骨组织关键的生理特性。 4. 明确的增效验证：系统性地证明了添加矿化胶原能显著上调多个成骨关键基因的表达，并促进矿化结节形成，而不会损害血管内皮功能，为利用生物活性材料进一步优化类器官性能提供了明确依据。 5. 平台优势突出：与传统的支架/基质依赖系统相比，该平台在成本效益、可重复性、可扩展性和操作简便性方面具有显著优势。
第七， 其他有价值的内容 研究团队也客观指出了当前模型的局限性：在静态培养约三周后，球体开始出现肿胀和结构软化迹象。这可能是由于较大球体核心区域的营养和氧气扩散受限，导致中心缺氧和细胞活力下降。为此，作者提出了未来的优化方向，包括整合灌注培养系统以增强物质交换、引入动态流动以模拟生理剪切应力、或使用透氧材料/局部释氧生物材料来支持长期培养。这些改进将进一步提升该平台在长期疾病建模和研究中的应用潜力。此外，论文中通过详细的对比表格，清晰列出了该无基质微流控平台与传统支架/Matrigel基3D培养系统在成本效益、可重复性、可扩展性等多个参数上的优劣，为读者提供了直观的参考。