本研究由美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention, CDC）病毒特殊病原体分支（Viral Special Pathogens Branch）的Punya Shrivastava-Ranjan、Jamie A. Kelly、Laura K. McMullan、Deborah Cannon、Laura Morgan、Payel Chatterjee、Shilpi Jain、Joel M. Montgomery、Mike Flint、César G. Albariño以及Christina F. Spiropoulou等人完成，于2025年5月19日发表在期刊《Viruses》上，论文标题为“Evaluating neutralizing antibodies in hantavirus-infected patients using authentic virus and recombinant vesicular stomatitis virus systems”。
汉坦病毒（hantavirus）属于汉坦病毒科（Hantaviridae），是引起严重人畜共患疾病的病原体，主要包括汉坦病毒肺综合征（hantavirus pulmonary syndrome, HPS）和肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）。其中，辛诺柏病毒（Sin Nombre virus, SNV）是北美HPS的主要病原，而安第斯病毒（Andes virus, ANDV）因具备人际传播能力而在南美洲受到高度关注。中和抗体（neutralizing antibodies, nAbs）在清除病毒和患者存活中发挥关键作用，因此中和试验（neutralization assays）对于理解机体免疫应答及评估治疗策略至关重要。然而，使用真实的汉坦病毒开展中和试验必须在生物安全3级（biosafety level 3, BSL-3）实验室中进行，存在显著的生物安全风险和操作复杂性。已有的慢病毒（lentivirus）和水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）假病毒系统虽然提供了部分替代方案，但它们在糖蛋白表达水平及病毒颗粒产量方面存在局限。因此，本研究旨在开发一种基于重组VSV的替代系统，在BSL-2条件下表达SNV和ANDV的糖蛋白前体（glycoprotein precursor, GPC），用于中和抗体检测，并与真实病毒中和试验进行比较，以验证该替代系统的可靠性。
在方法流程上，研究团队首先在生物安全2级（BSL-2）条件下构建了重组嵌合VSV病毒。他们利用反向遗传学技术，将VSV基因组中的天然糖蛋白G替换为SNV或ANDV的GPC编码序列，并在基因组中插入绿色荧光蛋白ZsGreen（ZSG）作为感染标志物。病毒拯救（rescue）过程使用Huh-7细胞，通过共转染表达VSV聚合酶、核蛋白、磷蛋白、T7 RNA聚合酶的质粒以及携带目标GPC的重组VSV基因组质粒。收获上清后，在Huh-7细胞中传代两次以扩增重组病毒，并测序确认基因组完整性。构建的重组病毒分别命名为VSV-SNV-ZSG和VSV-ANDV-ZSG。随后在Vero-E6和Huh-7两种细胞中比较病毒滴度，结果显示在Huh-7细胞中滴度更高，因此后续中和试验均采用Huh-7细胞。
在中和试验中，研究采用了两种类型的抗体材料：已发表的特征明确的单克隆抗体SNV-53和ANDV-44（由James Crowe惠赠），以及CDC存档的SNV感染患者血清样本。对于真实汉坦病毒中和试验，在BSL-3条件下将系列稀释的单克隆抗体或患者血清与真实SNV或ANDV混合后感染Huh-7细胞，72小时后固定细胞，利用针对ANDV核蛋白（nucleoprotein, NP）且可交叉识别SNV NP的多克隆抗体进行免疫荧光染色，使用Operetta高内涵成像系统检测感染细胞比例。对于重组VSV中和试验，在BSL-2条件下将同样稀释的抗体或血清与VSV-SNV-ZSG或VSV-ANDV-ZSG孵育1小时后感染Huh-7细胞，72小时后通过BioTek Synergy酶标仪测定ZSG荧光强度以定量感染率，并利用BioTek Cytation 3成像系统采集图像确认。数据分析采用GraphPad Prism 8.0.2的四参数非线性回归模型计算单克隆抗体的EC50值及患者血清的中和滴度（50%病毒抑制的血清稀释倍数）。
研究结果首先验证了单克隆抗体在真实病毒体系中的中和特异性。SNV-53对真实SNV的EC50为0.12±0.04 ng/mL，而对ANDV的EC50为5.3±0.4 ng/mL，显示有限的交叉中和；ANDV-44对真实ANDV的EC50为0.06±0.02 ng/mL，对SNV的EC50高达36.6±3.2 ng/mL，交叉中和更弱。该结果与此前发表的研究一致。在患者血清的真实SNV中和试验中，所有高IgG滴度样本均表现中和活性，但中和滴度差异较大。例如IgG滴度同为6400的样本703156的中和滴度超过25829，而样本9314091的中和滴度仅为9449，提示IgG滴度不能完全预测中和活性。低IgG滴度样本如SPR166的中和滴度仅为28，正常血清对照未检测到中和活性。
在重组VSV系统中，单克隆抗体的中和结果与真实病毒高度一致。SNV-53对VSV-SNV-ZSG的EC50为20.09 ng/mL，对VSV-ANDV-ZSG的EC50为59.47 ng/mL；ANDV-44对VSV-ANDV-ZSG的EC50为5.7 ng/mL，对VSV-SNV-ZSG的EC50高达1104 ng/mL。两者均未有效中和表达首尔病毒（Seoul virus, SEOV）GPC的对照重组病毒VSV-SEOV-ZSG，其中SNV-53对VSV-SEOV-ZSG的EC50为391.1 ng/mL，ANDV-44则超过10000 ng/mL。上述结果说明重组VSV系统可真实反映GPC介导的抗体识别特异性。在患者血清检测中，样本按中和滴度从弱到强被分为四组展示中和曲线，显示在BSL-2条件下可有效区分低、中、高滴度样本。进一步将VSV-SNV-ZSG与真实SNV两种体系对17份临床血清的中和滴度分组比较，结果显示15/17样本在两个体系中的高中低滴度分类完全一致，仅样本701976在真实SNV中为低滴度而VSV体系中为中等滴度，样本703114则在真实SNV中为高滴度而VSV体系中为中等滴度。总体而言，重组VSV系统与真实病毒体系的中和结果高度相关。
研究结论指出，重组VSV嵌合病毒系统在BSL-2条件下可有效用于汉坦病毒中和抗体检测，所得结果与BSL-3真实病毒中和试验基本一致，可作为安全、高效且易于推广的替代平台。作者指出，真实病毒体系仍是中和研究的金标准，但VSV系统适用于缺乏BSL-3设施的实验室，尤其适合高通量筛选治疗性抗体和抗病毒化合物。针对两种体系间少数样本滴度差异，作者推测VSV复制速度显著快于汉坦病毒，可能需要更高抗体浓度才能达到同等中和效果；此外，真实汉坦病毒表面GPC构象可能更有利于抗体结合，从而提高中和效率。该研究还强调，VSV作为疫苗平台在埃博拉疫苗等领域已有良好安全记录，且多个动物模型研究支持重组VSV表达汉坦病毒糖蛋白的生物安全性。综合来看，该研究为汉坦病毒血清学研究和抗病毒策略评估提供了重要工具。
该研究的亮点包括：第一，开发了可复制的重组VSV系统，与仅能单轮感染的假病毒系统相比，可实现高滴度病毒生产及荧光实时监测；第二，通过平行比较真实病毒和VSV替代系统，系统验证了替代平台的可靠性；第三，使用已发表特征明确的单克隆抗体和临床血清样本，覆盖了广泛的抗体中和谱和滴度范围；第四，无需固定和染色即可通过荧光信号定量感染率，简化实验流程并提高通量。此外，研究还提示了真实病毒与替代系统间滴度差异的可能机制，为未来优化替代系统提供了方向。该研究在方法学上为汉坦病毒中和抗体检测提供了新的实用工具，也在应用层面为疫苗和治疗性抗体的研发与评价奠定了基础。