本研究报告主要介绍武汉理工大学化学、化工与生命科学学院张梦瑶、陈刚、雷孟恒、雷佳庆、李丹与郑华教授（通讯作者）团队于2021年3月30日在线发表于国际期刊 international journal of biological macromolecules 的一项原创性研究成果。论文标题为“ph-sensitive oxidized-dextran based double drug-loaded hydrogel with high antibacterial properties”（pH敏感的氧化葡聚糖基双药负载水凝胶及其高抗菌性能研究）。
学术背景 本研究属于生物医用材料、药物递送和伤口感染治疗交叉领域。皮肤创伤后，细菌感染是导致伤口愈合延迟甚至不愈合的主要难题。临床上，局部应用抗生素是常见治疗手段，但抗生素浓度不足（亚抑制浓度）或过高均会带来问题：前者可能导致细菌耐药性，后者则可能产生肾毒性、耳毒性等副作用，并影响愈合进程。因此，开发一种能够根据感染微环境“按需”智能释放抗生素的递送系统至关重要。水凝胶作为一种高分子材料，因其良好的生物相容性、可负载药物、以及能够模拟细胞外基质等特性，在生物医学领域应用广泛。其中，天然多糖（如葡聚糖）因其良好的生物相容性和可修饰性备受关注。然而，许多天然多糖本身缺乏抗菌活性，通常需要与抗生素或金属离子结合。目前，针对细菌感染的智能抗菌水凝胶研究多集中于单药负载体系，关于双药协同、pH响应型智能水凝胶的报道较少。本研究的学术背景正是基于上述临床需求和研究现状，旨在构建一种基于氧化葡聚糖（Dex-CHO）、磺胺嘧啶（SD）和妥布霉素（TOB）的pH响应型双药负载智能水凝胶，以实现对局部细菌感染的“按需”协同治疗。
本研究的具体目标包括：1）合成并表征氧化葡聚糖（Dex-CHO）及其与磺胺嘧啶的接枝产物（Dex-CHO/SD）；2）利用Dex-CHO/SD和妥布霉素（TOB）通过席夫碱反应制备一系列不同TOB含量的水凝胶（DCST-1, DCST-2, DCST-3, DCST-6），并系统表征其凝胶时间、微观结构、溶胀、降解、自愈合及可注射性能；3）评估水凝胶的体外生物相容性（溶血性、细胞毒性）及体内长期毒性；4）研究水凝胶在不同pH环境下的药物释放动力学；5）通过体外和体内实验全面评价水凝胶的广谱抗菌性能及双药协同效应；6）最终验证该智能水凝胶系统作为局部细菌感染治疗新策略的可行性与潜力。
详细工作流程 本研究流程严谨，涵盖材料制备、表征、性能测试及生物学评价等多个环节。
第一步：材料合成与表征。 研究以分子量为40 kDa的葡聚糖（Dextran）为原料，采用高碘酸钠（NaIO₄）氧化法，将其部分羟基氧化为醛基，得到氧化葡聚糖（Dex-CHO）。通过羟胺盐酸盐滴定法测定其氧化度为28.8%。随后，将磺胺嘧啶（SD）的DMSO溶液与Dex-CHO水溶液混合，在50°C水浴中反应。SD分子中的氨基与Dex-CHO的醛基发生席夫碱反应，形成亚胺键（C=N），从而将SD接枝到多糖骨架上。通过透析、离心去除未反应的SD和DMSO，冻干后得到Dex-CHO/SD固体粉末。采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、紫外-可见光谱（UV-Vis）和核磁共振氢谱（¹H NMR）对Dex、Dex-CHO及Dex-CHO/SD的结构进行表征。FT-IR结果显示，Dex-CHO在1744 cm⁻¹处出现了醛基（-C=O）的特征吸收峰；Dex-CHO/SD则在1598 cm⁻¹处出现了亚胺键（C=N）的伸缩振动峰，同时在1506、1036、673 cm⁻¹等处出现了SD苯环的特征峰，证实了SD的成功接枝。UV-Vis显示Dex-CHO/SD在268 nm处有SD的特征吸收峰。¹H NMR谱中，SD伯胺基（-NH₂）的质子峰（δ 6.0）消失，进一步佐证了亚胺键的形成。计算得出SD在Dex-CHO/SD中的载药量为4%，接枝率为8.88%。
第二步：水凝胶的制备与理化性质表征。 分别配制Dex-CHO/SD水溶液（0.1 g/mL）和TOB水溶液（0.05 g/mL），按不同体积比（5:1， 3:1， 2:1， 3:2）混合，得到总TOB含量（wt%）分别为0.83%、1.25%、1.67%、2%的四组水凝胶，简称为DCST-6、DCST-3、DCST-2、DCST-1。TOB分子中的多个氨基与Dex-CHO/SD中剩余的醛基发生交联反应，形成三维网络结构。通过倒置小瓶法测定凝胶时间。利用扫描电子显微镜（SEM）观察冻干水凝胶的截面微观形貌。将水凝胶浸泡在不同pH（7.4和5.0）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于37°C孵育，定期称重计算其降解率。同时，将冻干水凝胶样品浸入pH 7.4的PBS中测定其溶胀率。为评估其作为注射材料的潜力，研究还测试了水凝胶的自愈合性能和可注射性：将染色的与未染色的水凝胶块接触，观察其融合情况；将预聚液吸入注射器内成胶后，挤出观察其形态。
第三步：生物相容性评价。 该部分包括体外和体内实验。1）溶血实验：采用长爪沙鼠血液制备2%红细胞悬液。设置实验组（加入DCST-3水凝胶）、阳性对照组（蒸馏水）和阴性对照组（生理盐水），分别与红细胞悬液共孵育后离心，观察上清液颜色，并用紫外分光光度计在545 nm处测定吸光度，计算溶血率。2）细胞毒性实验：采用CCK-8法检测L929小鼠成纤维细胞的存活率。测试样品包括Dex-CHO/SD、游离SD、游离TOB以及DCST-3水凝胶浸提液。将细胞与不同样品共培养24小时后，加入CCK-8试剂，测定吸光度计算细胞相对存活率。3）体内长期毒性实验：将10只雌性昆明小鼠随机分为两组，实验组小鼠背部皮下注射150 μL DCST-3水凝胶，对照组注射等量生理盐水。两周后处死小鼠，观察一般状态，采集血液进行血常规分析（白细胞WBC、淋巴细胞Lymph#、单核细胞Mon#、粒细胞Gran#、血小板PLT、红细胞RBC计数）。同时，取注射部位皮肤组织进行石蜡包埋、切片和苏木精-伊红（H&E）染色，于光学显微镜下观察组织病理学变化。
第四步：体外药物释放研究。 为模拟正常组织（pH 7.4）和细菌感染早期生物膜形成的微酸性环境（pH 5.0），研究分别在两种pH的PBS缓冲液中进行药物释放实验。取等量的四组水凝胶（DCST-6， -3， -2， -1），分别加入8 mL相应pH的PBS，于37°C恒温振荡。在预设时间点取样1 mL，并补充等量新鲜PBS。样品中的SD浓度直接用紫外分光光度计在243 nm波长下测定。TOB浓度则采用2,4-二硝基氟苯（DNFB）柱前衍生化结合高效液相色谱（HPLC）法进行测定：取样品溶液，加入DNFB和Tris溶液，60°C水浴加热衍生后，用HPLC在365 nm波长下检测。流动相为0.25% Tris-乙腈-0.5 mol/L硫酸溶液（40:59:1， v/v）。
第五步：体外抗菌活性评价。 选取革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S. aureus）和革兰氏阴性菌大肠杆菌（E. coli）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）作为测试菌株。实验在96孔板中进行，设置了9个处理组，每组5个重复孔。A组：Dex-CHO溶液；B组：Dex-CHO/SD溶液；C组：游离SD溶液（SD含量等同于DCST-3在pH 5.0下24小时的释放量）；D组：游离TOB溶液（TOB含量等同于DCST-3在pH 5.0下24小时的释放量）；E组：Dex-CHO/TOB水凝胶（Dex-CHO与TOB体积比同DCST-3）；F-I组：分别为DCST-6， -3， -2， -1水凝胶。每孔加入60 μL相应材料后，再加入100 μL细菌悬液（约10⁴ CFU/mL）。培养24小时后，采用涂布平板法测定各孔中活菌密度，以未加任何抑菌材料孔的活菌密度作为100%对照，计算各组的抑菌率。
第六步：体内抗菌活性评价。 将25只雌性昆明小鼠分为5组。所有小鼠均在背部皮下注射70 μL金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的混合菌液（约10⁸ CFU/mL）以建立感染模型。随后，四组小鼠分别在细菌注射区域皮下注射150 μL的Dex-CHO、Dex-CHO/SD、Dex-CHO/TOB和DCST-3水凝胶。第五组作为阳性对照组，仅注射菌液，不进行水凝胶处理。三天后处死所有小鼠，观察感染部位外观。取感染部位皮肤组织，一部分用4%多聚甲醛固定，进行石蜡包埋、切片，先后进行H&E染色和革兰氏染色，镜下观察组织炎症浸润和细菌残留情况。另一部分组织用无菌PBS匀浆，梯度稀释后涂布于LB平板，37°C培养24小时后进行菌落计数，定量分析各组组织的细菌负荷。
主要结果 材料表征结果： FT-IR、UV-Vis和¹H NMR数据共同证实了Dex-CHO的成功氧化以及SD通过亚胺键成功接枝到Dex-CHO上，氧化度为28.8%，SD载药量为4%。
水凝胶理化性质结果： SEM图像显示所有水凝胶均具有均匀、连续、多孔的三维网络结构，孔径完整光滑，骨架牢固。凝胶时间方面，DCST-6约为25分钟，其余三组（DCST-3， -2， -1）均小于10分钟，适合临床操作。水凝胶表现出良好的自愈合能力（两块凝胶接触10分钟后边界融合）和可注射性（可从注射器中完整挤出）。溶胀性能优异，四组水凝胶的溶胀率在953%至2017.5%之间，且随着TOB含量增加（交联密度增大），溶胀率呈下降趋势。降解实验表明，水凝胶在pH 7.4的PBS中7天内重量无显著变化，稳定性好；而在pH 5.0的酸性PBS中，7天内降解率达69.77%，证明了其酸响应特性，这归因于酸性条件下亚胺键的水解断裂。
生物相容性结果： 溶血实验中，DCST-3水凝胶组的溶血率仅为1.6%，低于国际标准（5%），表明其具有良好的血液相容性。细胞毒性实验中，Dex-CHO/SD及水凝胶浸提液处理组的细胞存活率很高，符合一级生物材料标准，而游离SD和TOB则显示出一定细胞毒性，说明水凝胶形式能有效降低药物的直接毒性。体内长期毒性实验中，水凝胶注射组小鼠的皮肤组织H&E染色与对照组无显著差异，血常规各项指标均在正常参考范围内，且与对照组无统计学差异，证明该水凝胶无明显的体内长期毒性。
药物释放结果： 药物释放曲线清晰显示了水凝胶的pH响应性和可控释放特性。在pH 5.0的酸性环境中，SD和TOB的释放速率和累积释放量均远高于pH 7.4的中性环境，这是因为酸性环境加速了亚胺键的水解和凝胶网络的降解。此外，随着TOB初始含量的增加（从DCST-6到DCST-1），水凝胶骨架结构更致密，药物释放速率相应减慢。这表明通过调节TOB的投料比，可以调控药物的释放动力学，实现“按需”给药。
抗菌活性结果： 体外实验显示，DCST-3水凝胶对三种测试菌株（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌）均表现出最强的抗菌效果，尤其对铜绿假单胞菌效果最佳。对比实验发现，单独的Dex-CHO、Dex-CHO/SD或游离SD抗菌效果有限；游离TOB和Dex-CHO/TOB水凝胶具有较好的抗菌性；而双药负载的DCST-3水凝胶抗菌效果显著优于任何单药体系，证明了SD（慢效抑菌剂，通过竞争性抑制细菌叶酸合成）与TOB（快效杀菌剂，通过抑制细菌蛋白质合成）之间存在协同抗菌效应。体内实验进一步验证了其高效性。仅注射细菌的对照组和Dex-CHO组小鼠背部出现严重溃疡；Dex-CHO/SD和Dex-CHO/TOB组感染较轻，皮肤略有红肿；而DCST-3水凝胶处理组小鼠背部皮肤完整，未见感染迹象。组织切片革兰氏染色显示，DCST-3组感染组织中几乎看不到紫色（革兰氏阳性菌）和粉色（革兰氏阴性菌）斑点，而其他组则有不同程度残留。菌落计数定量分析表明，DCST-3处理使感染部位的活菌数比单纯感染组降低了近4个数量级。
结论与意义 本研究成功设计并制备了一种基于氧化葡聚糖、负载磺胺嘧啶和妥布霉素的pH响应型智能双药水凝胶。该水凝胶制备方法简单，具有优异的溶胀性、可注射性、自愈合性和生物相容性。其核心创新在于利用了细菌感染微环境的酸性特性（pH ~5.0）触发亚胺键断裂，实现抗生素的“按需”可控释放。体外和体内实验均证实，该水凝胶能高效、协同地杀灭多种革兰氏阳性和阴性细菌，对治疗局部细菌感染展现出巨大潜力。
研究的科学价值与应用价值在于： 1）方法学创新：提供了一种构建pH响应、双药协同释放的智能水凝胶的简易且有效的策略。通过调节交联剂（TOB）的用量，可灵活调控凝胶的物理性质和药物释放动力学，为个性化治疗提供了可能。2）治疗策略创新：实现了基于感染微环境触发（on-demand）的精准药物递送，有望解决传统抗生素疗法中浓度不当导致的耐药性增强或毒副作用问题，提高治疗效率并减少抗生素滥用。3）材料设计创新：将TOB同时作为交联剂和药物组分，简化了制备流程，并减少了额外化学交联剂可能带来的毒性。4）临床转化潜力：该水凝胶优异的理化性能和生物安全性为其作为新型伤口敷料或局部感染治疗植入材料的临床应用奠定了坚实的实验基础。
研究亮点 1. 双药协同与智能释放的巧妙结合：首次将慢效抑菌剂SD和快效杀菌剂TOB通过pH敏感的席夫碱键共同整合到氧化葡聚糖水凝胶中，实现了在感染酸性微环境触发下的协同药物释放，抗菌效果显著优于单药体系。 2. “按需”给药机制的实现：精准利用了细菌生物膜早期形成的微酸性环境作为触发信号，使抗生素主要在感染部位高效释放，而在正常组织（中性pH）中释放极少，体现了高度的环境响应性和靶向性。 3. 优异的综合性能：所制备的水凝胶不仅具备良好的抗菌性能，还兼具可注射、自愈合、高溶胀、良好生物相容性和体内安全性等多重优点，符合理想伤口敷料的多项要求。 4. 简单高效的材料设计与制备工艺：整个制备过程基于天然多糖和已批准药物的化学反应，步骤相对简单，条件温和，具有良好的可重复性和放大生产潜力。 5. 全面系统的评价体系：研究从材料合成、理化表征，到体外细胞毒性、溶血性、药物释放、抗菌实验，再到体内长期毒性和感染模型治疗实验，构建了完整且严谨的性能评价链条，结论可靠。
该项研究为解决细菌感染伤口愈合难题提供了一种创新且前景广阔的智能材料解决方案，为相关领域的后续研究和临床转化提供了重要的设计思路和方法学参考。