本研究由Jianzhao Zhai、Ping Zhang、Naidan Zhang、Yubin Luo和Yongkang Wu共同完成，作者单位包括四川大学华西医院/华西临床医学院实验医学科（Jianzhao Zhai, Ping Zhang, Naidan Zhang）、四川大学华西医院风湿免疫科（Yubin Luo）以及四川大学华西医院门诊部（Yongkang Wu）。通讯作者为Yongkang Wu。该研究于2022年发表在期刊 Clinical Rheumatology 上。

学术背景

本研究属于风湿免疫病学与人类遗传学的交叉领域，聚焦于系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus, SLE）的遗传易感性研究。SLE是一种多发于育龄期女性的自身免疫性疾病，可累及多个器官系统，其发病机制复杂，涉及遗传、性激素、感染等多种因素。随着基因技术的发展，遗传因素在SLE中的作用日益受到重视。全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies, GWAS）已发现超过100个与SLE相关的基因位点，其中单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）是最常见的遗传变异形式之一。然而，已知的基因仍不能完全解释SLE的遗传病因。此外，自噬（Autophagy）作为一种细胞自我清除过程，其缺陷已被证明与炎症因子积累和SLE发生有关。

基于此背景，研究团队旨在深入探索与中国西部人群SLE易感性相关的特定遗传变异。他们此前对一个SLE家系进行了全外显子组测序（Whole Exome Sequencing），筛选出5个可能与SLE相关的候选SNP。本研究的核心目标是在更大规模的病例-对照样本中验证这些SNP与SLE易感性的关联，并进一步分析这些SNP与SLE患者实验室指标（如细胞因子、自身抗体水平）之间的关系，以期更深入地理解SLE的遗传学基础及其潜在的病理生理机制，为寻找新的治疗靶点提供线索。

详细研究流程

本研究是一个回顾性病例-对照研究，主要包含以下几个步骤：

1. 研究对象招募与分组： 研究从四川大学华西医院共招募了1034名参与者，分为两组： * SLE患者组：634名成年SLE患者，均根据1997年美国风湿病学会（American College of Rheumatology）的分类标准确诊。排除标准包括妊娠、患有肿瘤、败血症或其他自身免疫性疾病。所有患者均接受了包括糖皮质激素和羟氯喹在内的免疫抑制治疗。 * 健康对照组（HCs）：400名年龄和性别匹配的健康个体，无任何自身免疫性疾病或炎症性疾病。 本研究获得了四川大学华西医院伦理委员会的批准（批号：20190559），并同意豁免知情同意书。

2. SNP选择与基因分型： * SNP来源：基于团队前期的家系研究，对来自一个SLE家系的3名患者和1名对照进行了全外显子组测序，初步筛选出18个可能与SLE相关的SNP。本研究从中选择了5个与自噬过程相关的基因（WDFY4, PHLDB1, NCF2）内的SNP进行验证，具体为：WDFY4 rs3747874、WDFY4 rs7097397、PHLDB1 rs7389、NCF2 rs2274064、NCF2 rs2296164。 * DNA提取与基因分型：从所有参与者采集EDTA抗凝血样本，使用QuickGene DNA全血试剂盒提取外周血DNA。基因分型工作采用了由上海天昊生物科技有限公司开发的改进多重连接检测反应（improved Multiplex Ligation Detection Reaction, iMLDR）技术。该方法是一种基于多重PCR-连接酶检测反应的技术，通过等位基因特异性寡核苷酸探针对的荧光标记来区分等位基因，并通过3‘端延伸长度的不同来区分不同的SNP位点。这是一种高效、准确的高通量SNP分型方法。

3. 实验室指标检测： 对SLE患者进行了全面的实验室检查，以分析基因型与临床指标的关系，检测内容包括： * 补体与免疫球蛋白：采用免疫比浊法检测补体3（C3）、补体4（C4）和免疫球蛋白。 * 血常规：使用全自动血液分析仪检测。 * 血液生化指标：采用分光光度法检测，包括总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、胆固醇（CHOL）、高/低密度脂蛋白胆固醇（HDL-C, LDL-C）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素、肌酐（Crea）、胱抑素C（Cys-C）和尿酸（Uric）。 * 自身抗体：采用间接免疫荧光法（IIF）检测抗核抗体（ANA）和抗双链DNA抗体（anti-dsDNA）；采用免疫印迹法检测抗RNP、抗Sm、抗SSA、抗SSB和抗核糖体抗体（anti-Rib）。 * 细胞因子：从SLE患者中随机选取143份样本，使用R&D人类炎症检测试剂盒检测了13种细胞因子，包括IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、IP-10、CD40L、颗粒酶B、IL-21、IL-4、TNF-α、IL-18和IL-33。 * 疾病活动度评估：由经验丰富的风湿病专家评估SLE疾病活动指数（SLEDAI）评分。

4. 数据分析流程： * 连锁不平衡分析：使用Haploview软件（4.2版）分析WDFY4和NCF2基因内SNP之间的连锁不平衡关系。 * 群体遗传学分析：使用卡方检验评估各SNP在病例组和对照组中的基因型分布是否符合哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE）。 * 关联性分析：使用SPSS 25.0软件进行统计分析。采用Mann-Whitney U检验比较病例组与对照组的基本特征。采用卡方检验比较不同基因型在病例组和对照组中的分布差异，计算优势比（Odds Ratio, OR）和95%置信区间（95% CI）以评估基因型风险。采用GraphPad Prism 9.0绘制图形。 * 统计显著性控制：采用双侧检验，p值<0.05被认为具有统计学意义。为控制多重比较带来的假阳性率，使用q值进行错误发现率（False Discovery Rate, FDR）校正。 * 统计效能计算：使用G*Power软件（3.1.9.6版）计算了研究的统计效能。

主要研究结果

1. 研究对象特征与SNP分型质量： SLE患者组与健康对照组在年龄和性别上匹配良好。SLE患者表现出多种狼疮相关临床表现，如狼疮性肾炎（60.09%）、神经精神性狼疮（8.36%）、关节炎（27.60%）等。基因分型结果显示，除rs3747874在SLE组中偏离HWE（p=0.017）外，其余四个SNP（rs7097397， rs7389， rs2274064， rs2296164）在两组中的基因型分布均符合HWE（p>0.05）。连锁不平衡分析显示，WDFY4基因的两个SNP（rs3747874和rs7097397）以及NCF2基因的两个SNP（rs2274064和rs2296164）各自存在连锁不平衡。

2. SNP与SLE易感性的关联： 在5个候选SNP中，有两个SNP的基因型分布在SLE患者和健康对照之间存在显著差异（经FDR校正后）： * PHLDB1 rs7389 T/G：G等位基因是SLE的保护因素。 * 显性模型（GT+GG vs. TT）：OR = 0.627， 95% CI = 0.480–0.820， p = 0.001， q = 0.002。 * 隐性模型（GG vs. GT+TT）：OR = 0.609， 95% CI = 0.441–0.842， p = 0.003。 * 等位基因模型（G vs. T）：OR = 0.694， p < 0.001。 * WDFY4 rs7097397 G/A：A等位基因是SLE的保护因素。 * 显性模型（GA+AA vs. GG）：OR = 0.653， 95% CI = 0.438–0.973， p = 0.035， q = 0.033。 * 隐性模型（AA vs. GA+GG）：OR = 0.712， 95% CI = 0.553–0.917， p = 0.008。 * 等位基因模型（A vs. G）：OR = 0.753， p = 0.003。 其他三个SNP（rs3747874， rs2274064， rs2296164）在两组间未发现显著差异。值得注意的是，NCF2基因的两个SNP检验效能低于0.75，可能存在II类错误。

3. SNP基因型与生化参数及自身抗体的关联： * 生化参数：在FDR校正前，rs7389的GG基因型与较低的血清总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）水平相关（p值分别为0.010和0.007），但校正后这些差异不再显著。rs7097397不同基因型间的生化参数分布无显著差异。 * 自身抗体：rs7097397的AA基因型携带者，其ANA阳性率显著高于GA+GG基因型携带者（94.00% vs. 86.72%， q = 0.021）。其他自身抗体（如抗dsDNA、抗RNP、抗Sm等）的阳性率在不同基因型间无显著差异。rs7389不同基因型间的各种自身抗体阳性率均无显著差异。

4. SNP基因型与细胞因子水平的关联： 对143名SLE患者的细胞因子分析显示： * PHLDB1 rs7389：不同基因型患者的TNF-α水平存在显著差异（q = 0.013）。携带G等位基因（GT和GG基因型）的患者，其TNF-α水平中位数（TT: 3.81 pg/ml； GT: 6.64 pg/ml； GG: 7.04 pg/ml）高于TT纯合子患者。 * WDFY4 rs7097397：不同基因型患者的IL-1β和IL-6水平存在显著差异。 * IL-1β水平：AA基因型最低（3.15 pg/ml），GA次之（4.08 pg/ml），GG最高（5.01 pg/ml），q = 0.033。 * IL-6水平：同样呈现AA基因型最低（2.90 pg/ml），GA次之（4.80 pg/ml），GG最高（6.09 pg/ml），q = 0.039。

研究结论

本研究通过对中国西部人群的大规模病例-对照分析，证实了从SLE家系中筛选出的两个SNP与SLE易感性相关： 1. PHLDB1基因的rs7389 T/G多态性：G等位基因可降低中国西部人群患SLE的风险，同时与SLE患者体内较高的TNF-α水平相关。 2. WDFY4基因的rs7097397 G/A多态性：A等位基因可降低中国西部人群患SLE的风险，同时与SLE患者体内较低的IL-1β和IL-6水平相关，但 paradoxically 与较高的ANA阳性率相关。

研究意义与价值

科学价值： * 新位点发现：首次在中国人群（特别是西部人群）中报道了PHLDB1 rs7389与SLE易感性的关联，为SLE的遗传图谱增添了新的数据。 * 功能关联探索：不仅验证了SNP与疾病风险的关联，还深入分析了其与关键细胞因子（TNF-α， IL-1β， IL-6）和自身抗体（ANA）的表型关联，为理解这些基因变异如何影响SLE的免疫病理过程提供了线索。例如，rs7389 G等位基因与高TNF-α相关，而TNF-α下调可增加Akt磷酸化，提示了PHLDB1可能通过影响TNF-α/Akt通路参与SLE。 * 机制假说：结合文献，对WDFY4和PHLDB1基因在免疫和自噬中的作用进行了讨论，提出了潜在的作用机制假说。例如，WDFY4可能通过抑制非经典自噬途径影响抗原呈递和B细胞分化，从而参与SLE发病；其A等位基因虽然降低疾病风险，却与高ANA相关，提示其可能独立地促进B细胞产生抗体。

应用潜力：该研究为SLE的精准医疗提供了潜在的遗传学标记物。未来或可基于这些SNP进行风险预测，并针对其调控的免疫通路（如自噬、PI3K/Akt/mTOR通路、细胞因子网络）开发新的靶向治疗策略。

研究亮点

1. 研究策略创新：采用了“家系发现-群体验证”的经典遗传学研究策略。首先通过一个SLE家系的全外显子组测序发现候选SNP，随后在大规模独立病例-对照样本中进行验证，提高了发现的可靠性。
2. 表型关联深入：超越了简单的易感性关联分析，将遗传变异与详细的实验室免疫表型（多种细胞因子和自身抗体谱）相结合，有助于 bridging the gap between genetic association and functional consequence。
3. 人群特异性：聚焦于中国西部人群，补充了亚洲人群SLE遗传学数据，有助于理解疾病遗传背景的人群异质性。
4. 技术方法可靠：使用了高效的iMLDR技术进行高通量SNP分型，并严格进行了统计学校正（FDR），保证了结果的质量。

其他有价值的内容

• 研究局限性：作者坦诚指出了本研究的局限性，包括缺乏对WDFY4和PHLDB1基因或蛋白的功能学研究，以及研究对象仅限于中国西部人群，可能存在人群特异性，未来需要在其他人群和功能实验中进一步验证和完善。
• 统计效能考量：研究明确指出了NCF2基因SNP检验效能不足的问题，体现了严谨的科研态度。
• 对自噬通路的关注：SNP的筛选基于其所在基因与自噬的相关性，将遗传学研究与当前SLE发病机制的热点领域（自噬）紧密联系，提升了研究的理论深度。

这项研究是一项设计严谨、分析深入、具有重要发现的风湿病遗传学研究，为理解SLE在中国人群中的遗传基础及其免疫学机制贡献了有价值的数据和见解。