学术报告

这项研究由Ailing Bao、Wenjing Jiang、Xiansong Xie、Deyuan Wang、Ziquan Deng、Jingwen Wang、Weiyi Li、Xiaorong Tang 和 Yingkun Yan 等学者完成，发表于《Journal of Medicinal Chemistry》，2024年第67卷（页码7954-7972）。本文主要集中在新型4H-吡喃[3,2-c]吡啶衍生物的设计、合成、生物活性评价以及分子动力学模拟，研究这些化合物作为潜在的14α-脱甲基酶（CYP51）抑制剂的可能性。

学术背景

本研究属于药物化学和真菌学研究领域，重点探索新型杀菌剂的研发。杀菌剂的作用在于控制植物病害，目前市售杀菌剂主要分为三大类：(1)甾醇14α-脱甲基酶抑制剂（DMIs）；(2)琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHIs）；(3)线粒体呼吸链复合物III抑制剂（QoIs和QIIs）。DMIs通过结合CYP51中亚铁血红素的铁离子来抑制该酶的催化活性，从而破坏真菌麦角固醇的生物合成。麦角固醇是真菌质膜的基本成分，其缺失将导致细胞膜的功能丧失，最终导致真菌死亡。

尽管DMIs在农业中的应用广泛，但长期单一靶点的反复使用已经导致一些植物病原真菌（如Blumeria graminis、Cercospora beticola、Uncinula necator等）对这一类药物产生了抗性。因此，开发具有新颖作用机制、更优越性能及低毒性的新型CYP51抑制剂已经成为迫切需求。据作者介绍，这是首次将4H-吡喃[3,2-c]吡啶衍生物（含吡喃和吡啶骨架）作为潜在DMIs进行系统研究。

研究工作流程与实验方法

设计与合成：
在药效团组合原则指导下，共设计并合成了34种4H-吡喃[3,2-c]吡啶衍生物，并在其中引入了呋喃和噻吩骨架。这两种基团的氧原子和硫原子各自具有两个孤对电子，可参与金属离子配位反应，且容易与蛋白质分子中的氨基酸残基形成氢键，提高了化合物与靶点的结合活性。

• 目标化合物通过缩合反应（Claisen-Schmidt反应）、Michael加成、环化等反应步骤合成，中间体使用复晶技术和硅胶柱色谱进行纯化处理。
• 化合物的结构通过红外光谱（IR）、核磁共振氢谱（1H NMR）、核磁共振碳谱（13C NMR）以及高分辨质谱（HRMS）进行表征。

化学纯度分析：
通过高效液相色谱（HPLC）分析确认，目标化合物的纯度均大于95%。

生物活性测定与筛选：
使用商业杀菌剂Epoxiconazole作为对比标准，测试目标化合物对以下植物病原真菌的杀菌活性： 1. Sclerotinia sclerotiorum
2. Colletotrichum lagenarium
3. Botrytis cinerea
4. Penicillium digitatum
5. Fusarium oxysporum

测定化合物的半数有效浓度（EC50）和半数抑制浓度（IC50），以评估其杀菌活性和对CYP51的抑制作用。同时，通过荧光淬灭实验探讨化合物与CYP51的相互作用。

分子动力学模拟（MD）：
为了研究化合物与靶点之间的结合模式，进一步进行了40 ns的分子动力学模拟，模拟计算结合自由能，并分析药物活性化合物与蛋白质关键氨基酸残基的相互作用。

研究结果

1. 化学和结构表征：
   所有合成的目标化合物均通过表征验证其结构正确性。同时，部分化合物采用单晶X射线衍射方法分析，结果显示其含有丰富的氢键和π-π作用，这些特性可能有助于其高效的靶点结合能力。

2. 生物活性：

• 大部分化合物在16 μg/ml时表现出对多种真菌的显著杀菌活性，其中化合物7a、7b和7f在针对Botrytis cinerea的测试中表现出优于Epoxiconazole的效果（EC50分别为0.326, 0.530和0.610 μg/ml，而Epoxiconazole的EC50为0.670 μg/ml）。
• 目标化合物还表现出对CYP51的强力抑制作用，其中化合物7a、7b和7f的IC50分别为0.377, 0.611和0.748 μg/ml，相较于Epoxiconazole（IC50为0.802 μg/ml）更具优势。

1. 荧光淬灭与分子模拟：
   荧光淬灭实验表明，化合物7a和7b的作用机制可能与Epoxiconazole相似，均通过与CYP51目标结合起作用。分子动力学模拟验证了这一结果：

   • 化合物7a与CYP51的结合自由能（－35.4 kcal/mol）优于Epoxiconazole（－27.6 kcal/mol）。
   • 模拟显示化合物7a与靶点的结合位点有多个共同氨基酸残基，但贡献能量更强，进一步支持了其更优的活性。

2. 细胞毒性测试：
   在针对HEK293正常细胞系的细胞毒性测试中，化合物7a、7b和7f的毒性与Epoxiconazole水平相当甚至更低，显示其具有较高的安全性和潜在的应用价值。

结论与意义

本研究基于合理的药物设计与合成策略，成功开发了一系列具有显著杀菌活性的新型4H-吡喃[3,2-c]吡啶衍生物。化合物7a、7b和7f在抗Botrytis cinerea以及CYP51酶抑制的实验中展现了出色的表现，其活性均优于现有农药Epoxiconazole。这些化合物具有作为潜在新型DMIs杀菌剂的开发潜力，从而为解决药物抗性问题提供了新方案。本研究不仅在药物化学领域具有重大科学价值，同时对农业病害防治具有广泛应用前景。

研究亮点

1. 本研究是首次将4H-吡喃[3,2-c]吡啶骨架应用于甾醇14α-脱甲基酶抑制剂的系统研究，具有创新性。
2. 化合物7a、7b和7f具有优异的杀菌活性和靶点酶抑制效果，结合能显著优于现有药物。
3. 研究结合了药物设计、生物活性评价、分子模拟等多种技术，实验流程严谨且数据全面。

通过进一步的结构优化，相关化合物有望发展为具有高效、低毒性的新型农业杀菌剂，并为药物开发领域带来新的视角。