该文档发表于《Scientific Reports》期刊，2018年。主要作者为Magdalena Kasendra、Alessio Tovaglieri、Sasan Jalili-Firoozinezhad等，通讯作者为David T. Breault和Donald E. Ingber。作者团队主要来自哈佛大学威斯生物启发工程研究所、波士顿儿童医院、哈佛医学院、麻省理工学院、Mayo Clinic以及欧洲多所大学和研究机构。

本研究属于生物医学工程和组织工程领域，具体涉及“器官芯片”技术。研究的背景在于，尽管三维（3D）肠道类器官（intestinal organoids）在模拟肠道上皮细胞多样性方面取得了成功，但它们存在显著的局限性：其封闭的腔体结构不符合生理状态，导致分泌物和凋亡细胞无法被清除；细胞顶端表面难以接触，限制了运输研究以及与微生物的长期共培养；此外，类器官缺乏组织-组织界面（如血管内皮）、机械力（流体流动和蠕动）以及免疫细胞等对正常肠道生理和疾病发展至关重要的成分。因此，迫切需要开发更复杂、生理相关性更高的肠道器官培养系统。本研究旨在结合肠道类器官和器官芯片两种先进技术，开发一种新型的原代人小肠芯片模型，以更真实地模拟人体小肠的结构和功能。

详细工作流程： 本研究的工作流程主要分为几个关键步骤：1）原代肠道类器官的建立与培养；2）肠道芯片的构建与细胞接种；3）芯片的培养与分化；4）形态学与功能表征；5）转录组学比较分析。

1. 原代肠道类器官的建立与培养： 研究使用从健康人十二指肠内窥镜活检或手术样本中分离的肠道隐窝。这些组织样本来自10-14岁患者的正常区域，经过伦理审查和知情同意。隐窝在含有Wnt3a、表皮生长因子（EGF）、Noggin和R-spondin 1（合称WENR）的基质胶中培养，形成并长期扩增三维肠道类器官。这些类器官包含Lgr5+肠道干细胞，并能分化为多种肠道上皮细胞类型。类器官在扩增培养基中培养3-5天后，用于后续芯片接种。

2. 肠道芯片的构建与细胞接种： 使用的器官芯片由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，包含两个平行的细胞培养微通道：一个上层的“上皮”通道和一个下层的“血管”通道，中间由一层多孔、涂有细胞外基质（ECM，I型胶原和基质胶）的柔性PDMS膜隔开。每个通道有独立的入口和出口，用于灌注培养基和控制流体流动。芯片两侧还有中空腔室，通过施加循环真空可以拉伸和放松中央的柔性膜，模拟肠道的蠕动运动。 为了构建肠道芯片，首先将培养成熟的十二指肠类器官酶解成片段（而非单细胞），然后将这些片段接种到芯片上层通道的多孔膜顶部。同时，将原代人肠道微血管内皮细胞（HIMECs）接种到同一多孔膜的下表面（即下层通道内）。对照实验设置仅接种上皮细胞（无内皮细胞）的芯片。接种后，芯片在静态条件下培养过夜，随后开始连续灌注培养基。上层通道灌注上皮扩增培养基（EM），下层通道灌注内皮细胞培养基（EGM2-MV）。在形成融合的单层后（约3-4天），开始施加模拟蠕动的循环机械拉伸（10%应变，0.2 Hz）。培养第8天，将上层通道的培养基从EM更换为分化培养基（DM，不含Wnt3a并添加Notch信号抑制剂DAPT），以诱导上皮细胞的多谱系分化，共培养12天。

3. 芯片的培养与分化： 研究比较了不同接种条件（类器官片段 vs. 单细胞；有 vs. 无内皮细胞共培养）以及不同培养条件（有 vs. 无流体流动；有 vs. 无机械拉伸）对上皮形成和形态发生的影响。关键发现包括：使用类器官片段接种的成功率和效率远高于单细胞；与肠道微血管内皮细胞共培养可显著加速上皮融合（2天 vs. 6天）；流体流动是形成绒毛样结构所必需的，而机械拉伸在无流动条件下不能诱导结构变化；在流体流动、机械拉伸和内皮细胞共培养的共同作用下，芯片内形成了发育良好的、具有指状绒毛样突起的三维上皮结构。

4. 形态学与功能表征： 通过相差显微镜、微分干涉相差（DIC）显微镜、激光扫描共聚焦免疫荧光显微镜和扫描电子显微镜（SEM）对芯片结构进行详细分析。结果显示，形成的绒毛样结构顶端面向开放的流道腔，这与体内肠道一致，而与类器官的封闭腔体相反。免疫荧光染色证实了上皮细胞的极性分布：顶端刷状缘表达F-肌动蛋白、villin和NHE3；基底侧表达整合素β4和Na+/K+-ATP酶；侧壁表达E-钙粘蛋白。紧密连接蛋白ZO-1和血管内皮钙粘蛋白（VE-cadherin）的染色显示上皮和内皮均形成了完整的连接。 通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测了分化后多种肠道细胞谱系特异性标志物的表达，包括吸收性肠细胞（碱性磷酸酶、蔗糖酶-异麦芽糖酶）、杯状细胞（MUC2， MUC5AC）、肠内分泌细胞（嗜铬粒蛋白A、突触素）和潘氏细胞（溶菌酶）。与未分化状态（第8天）相比，分化后（第12天）这些标志物表达显著上调，而肠道干细胞标志物Lgr5表达下调，证明了芯片支持多谱系分化。 功能测试包括：a) 屏障功能：通过测量荧光染料Lucifer Yellow（450 Da）从上皮通道到血管通道的旁细胞渗透性来评估。芯片在12天培养期内形成了强大的屏障功能，其表观渗透系数与之前报道的Caco-2肠道芯片相似。b) 消化功能：通过测量刷状缘酶蔗糖酶-异麦芽糖酶的活性来评估。芯片灌注蔗糖后，在上皮通道流出液中检测到葡萄糖生成，且酶活性随培养时间增加，与Caco-2肠道芯片相当。c) 黏液分泌：通过酶联免疫吸附测定法检测上皮通道流出液中MUC2的含量。原代肠道芯片分泌的MUC2水平比Caco-2肠道芯片高10倍。

5. 转录组学比较分析： 这是本研究的关键创新点之一。研究人员对培养12天的原代肠道芯片进行了全转录组分析，并与多种样本进行了比较：a) 用于接种芯片的相同来源的十二指肠类器官（在相同培养条件下）；b) 人体内十二指肠、空肠和回肠组织（来自基因表达综合数据库）；c) 之前报道的基于Caco-2细胞系的肠道芯片和静态Transwell培养模型。 通过基因本体（GO）分析和模板匹配方法，重点关注了与肠道关键功能相关的基因集，包括消化系统过程、对营养物质的反应、药物转运、上皮细胞增殖的调节以及宿主防御反应。结果显示，基于原代细胞的肠道芯片和十二指肠类器官的转录组都比基于Caco-2细胞的模型更接近体内十二指肠。更重要的是，头对头比较显示，肠道芯片在转录组水平上比提供其细胞的类器官更接近活体十二指肠。通过计算皮尔逊相关系数并进行Fisher Z转换证实，肠道芯片与十二指肠的相似性显著高于类器官与十二指肠的相似性。特别是在宿主防御反应、消化、对营养物质的反应、药物转运和细胞增殖等功能相关基因的表达上，肠道芯片比类器官更接近体内状态。

主要结果： 1. 成功构建了原代人小肠芯片：该芯片结合了活检来源的类器官上皮和肠道特异性微血管内皮细胞，在流体流动和循环机械拉伸下，形成了具有绒毛样结构的极化上皮，并实现了多谱系分化。 2. 共培养和机械力学的关键作用：肠道微血管内皮细胞共培养加速了上皮单层形成。流体流动是绒毛样形态发生所必需的。 3. 再现了关键的肠道功能：芯片表现出强大的屏障功能、刷状缘酶消化活性以及活跃的黏液分泌功能。 4. 转录组更接近体内状态：全转录组分析证明，原代肠道芯片比其来源的类器官，以及其他体外模型（包括Caco-2芯片），更准确地模拟了活体人十二指肠的基因表达谱，尤其是在器官水平功能相关的基因上。 5. 技术可重复性与个体化潜力：研究使用来自三个不同供体的类器官成功构建了肠道芯片，并展示了功能评估结果的一致性，证明了该技术的可重复性，并为其用于个性化医学研究提供了可能。

结论与意义： 本研究成功开发了一种新型的、生理相关性更高的原代人小肠芯片模型。该模型不仅复现了小肠的关键解剖结构（绒毛样结构、极化上皮、组织-组织界面）和细胞组成（多种分化细胞类型），还模拟了重要的生理功能（屏障、消化、分泌）和机械微环境（流动、蠕动）。最重要的是，转录组学证据表明，该芯片在分子水平上比其前体——类器官——更接近真实的人体小肠组织。 这项研究的科学价值在于，它提供了一种介于传统二维细胞培养、三维类器官与整体动物实验之间的强大研究工具。它克服了类器官的局限性（如封闭腔体、缺乏血管和机械力），能够更真实地模拟器官水平的复杂生理和病理过程。其应用价值广泛，包括：研究肠道发育、干细胞分化和上皮细胞生物学；评估营养物质转运、吸收和代谢；研究药物吸收、分布、代谢、排泄和毒性；建立宿主-病原体相互作用模型以研究肠道感染；未来整合免疫细胞、成纤维细胞或肠道神经系统以构建更复杂的模型；以及利用患者特异性细胞进行个性化医疗研究，例如疾病机制研究和个体化药物反应测试。

研究亮点： 1. 技术整合创新：首次将原代活检来源的肠道类器官技术与微流体器官芯片技术成功结合，创建了血管化的、具有机械活性的小肠模型。 2. 生理相关性突破：模型不仅包含了原代上皮和器官特异性内皮，还引入了关键的生理机械力（流体剪切力和周期性应变），从而形成了更接近体内的三维结构和功能。 3. 强有力的分子验证：通过头对头的全转录组学比较，提供了直接证据，证明该芯片模型在基因表达水平上比其细胞来源——类器官——更接近真实人体组织，这是评估体外模型仿生度的关键进步。 4. 功能全面性：同时实现了形态发生、多谱系分化、屏障功能、酶活性和分泌功能的多维度验证，展示了模型的综合性能。 5. 可访问性与采样优势：芯片的开放式顶端管腔允许持续灌注和收集流出液，便于进行动态的养分消化、药物转运、代谢物和细胞因子分泌的定量分析，这是封闭式类器官难以实现的。 6. 个性化医疗潜力：证明了使用不同个体来源的活检组织构建芯片的可行性，为未来开发患者特异性疾病模型和个性化药物测试平台奠定了基础。

其他有价值的内容： 研究还讨论了该模型的未来发展方向，例如通过引入化学梯度（如Wnt、生长因子）或添加隐窝周围间充质细胞来进一步改善绒毛/隐窝区室化；整合免疫细胞、成纤维细胞和肠道神经系统以增加复杂性；以及应用于诱导多能干细胞来源的类器官以扩大细胞来源。文章也指出了该芯片技术在基础研究、疾病建模、药物开发和毒理学、营养学以及再生医学等领域的广阔应用前景。