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日本食源性疾病暴发中非O1/非O139霍乱弧菌的基因组与致病性分析
作者与机构
本研究由日本国立感染症研究所（National Institute of Infectious Diseases）的Masatomo Morita、长崎大学热带医学研究所（Institute of Tropical Medicine, Nagasaki University）的Toshio Kodama等团队合作完成，发表于*Microbial Genomics*期刊（2025年2月，DOI: 10.1099/mgen.0.001364）。
学术背景
研究领域与动机
霍乱弧菌（*Vibrio cholerae*）根据O抗原分为200多种血清群，其中仅O1和O139与霍乱大流行相关。然而，非O1/非O139血清群（简称NAGs）虽不引起典型霍乱，但可导致散发性腹泻，其致病机制多样且不明确。2013年，日本两县暴发三起食源性疾病，流行病学调查指向食用螺类（veined rapa whelk），但患者和食物样本中分离出多种血清群的NAGs，传统方法无法确定致病菌株。因此，本研究通过全基因组分析结合实验验证，旨在明确致病血清群及其毒力因子。
关键科学问题
1. 血清群混杂性：食物样本中分离出11种血清群（如O21、O144等），患者样本以O144为主（30/33），但混杂O176和未分型菌株。
2. 毒力因子异质性：NAGs的毒力因子（如T3SS、溶血素等）分布不均，需实验验证其功能。
研究流程与方法
1. 样本收集与血清分型
- 样本来源：64株NAGs（33株来自患者粪便，31株来自食物），覆盖3次暴发事件。
- 血清分型：采用玻片凝集试验（slide agglutination test），鉴定出O144（32株）、O49（9株）等11种血清群，其中患者样本以O144为主。
2. 全基因组测序与组装
- 测序策略：
- 短读长测序（Illumina HiSeq/MiSeq）：25株代表菌株（覆盖所有血清群）的DNA提取后建库，使用SPAdes v.3.13.1组装。
- 长读长测序（PacBio RS II）：对O144代表株V130003完成全基因组测序，通过HGAP 3组装并填补缺口。
- 注释：使用DDBJ FAST工具完成基因注释，提交至GenBank（染色体1：AP024967；染色体2：AP024968）。
3. 泛基因组与系统发育分析
- 泛基因组分析（Roary v.3.13.0）：比较25株菌的基因组成，发现O144特异性基因228个，其中III型分泌系统2α（T3SS2α）为唯一已知毒力因子。
- 系统发育树（IQ-TREE v.2.1.2）：基于核心基因组SNVs（单核苷酸变异），证实O144菌株成簇，与O176/未分型菌株无演化关联，排除血清群转换可能。
4. T3SS2α功能验证
- 基因敲除：在食物分离株V130055（O144）中构建双突变体（∆*hlya*∆*vscv2*），敲除溶血素（*hlya*）和T3SS结构基因（*vscv2*）。
- 蛋白分泌检测：Western blot证实突变体丧失T3SS效应蛋白VspB2的分泌能力。
- 兔回肠环试验（rabbit ileal loop test）：野生型O144引起显著肠液积累（FA比率：1.2 mL/cm），而∆*hlya*∆*vscv2*突变体毒性消失（FA比率：0.3 mL/cm，p<0.01），证明T3SS2α是致病关键。
主要结果
- 血清群特异性：患者与食物共有的O144菌株为核心致病株，系统发育分析显示其单克隆传播（SNV差异≤2）。
- 毒力因子鉴定：O144菌株携带T3SS2α基因组岛（含*trh*溶血素基因），其基因簇与印度O144菌株同源，提示水平基因转移。
- 致病机制：T3SS2α通过分泌效应蛋白（如VopM）介导肠毒素活性，独立于溶血素。
结论与意义
- 科学价值：首次证实O144 NAGs的T3SS2α是食源性疾病暴发的关键毒力因子，为NAGs的致病机制研究提供范例。
- 应用价值：
- 公共卫生：全基因组方法可辅助传统微生物学鉴定混合感染中的致病株。
- 数据库建设：建议建立病原菌基因组数据库，以快速识别环境与暴发菌株的风险。
研究亮点
- 多组学整合：结合基因组学（SNV分析、泛基因组）、分子实验（基因敲除）和动物模型，系统性解析NAGs致病性。
- 方法创新：开发基于自然转化（natural transformation）的NAGs基因编辑方案，解决传统电转效率低的问题。
- 跨地域关联：发现日本与印度O144菌株共享T3SS2α，提示该毒力岛可能通过水产贸易传播。
其他价值
- 技术细节：公开了PacBio长读长组装流程和突变体构建引物（如*nag-dhlya-1*等），可供同行复现。
- 伦理合规：动物实验获长崎大学伦理委员会批准（编号：2303221848-3），符合国际规范。
此研究为食源性疾病溯源提供了“基因组+功能验证”的双重证据链范式，未来可扩展至其他复杂病原体的鉴定。