关于“Gli1+祖细胞通过Hh和IGF信号通路介导特立帕肽的骨合成代谢功能”研究的学术报告
一、 研究作者、机构及发表信息 本研究由Yu Shi、Xueyang Liao、James Y. Long、Lutian Yao、Jianquan Chen、Bei Yin、Feng Lou、Guangxu He、Ling Ye、Ling Qin和通讯作者Fanxin Long*合作完成。研究团队主要来自美国费城儿童医院外科、宾夕法尼亚大学骨科、四川大学华西口腔医院、苏州大学医学院骨科研究所、中南大学湘雅二医院骨科及纽约大学库朗数学科学研究所等多个机构。该研究成果于2021年8月17日发表在Cell Reports期刊上（卷36，第7期，文章号109542）。这是一篇在CC BY许可下的开放获取文章。
二、 学术背景与研究目的 本研究属于骨骼生物学与骨代谢疾病治疗领域，聚焦于骨合成代谢药物作用机制的细胞与分子基础。特立帕肽（Teriparatide），即人甲状旁腺激素（PTH）的N端片段，是全球处方最广泛的骨合成代谢药物，用于治疗骨质疏松症。它能有效刺激骨形成，但其在体内的具体细胞靶点尚未完全阐明。已知在出生后生长的小鼠中，表达Gli1的干骺端间充质祖细胞（Gli1+ Metaphyseal Mesenchymal Progenitors, MMPs）是骨小梁成骨细胞的主要来源。然而，MMPs是否以及如何响应特立帕肽的刺激，其内在的细胞异质性如何，相关的信号通路是什么，这些都是悬而未决的关键科学问题。
先前研究表明，Hedgehog（Hh）信号通路，特别是印度豪猪蛋白（Indian Hedgehog, Ihh），在软骨内成骨和成骨细胞分化中至关重要。Gli1既是Hh信号的效应因子也是其转录靶标，是Hh响应细胞的标志。此外，Hh信号可通过激活胰岛素样生长因子（Insulin-like Growth Factor, IGF）信号通路形成正反馈环路以诱导成骨细胞分化。但IGF信号在Hh响应的MMPs中的作用及其与特立帕肽信号的交联尚不清楚。
因此，本研究旨在：1）明确特立帕肽是否以及如何影响Gli1+ MMPs；2）解析MMPs群体的细胞异质性；3）探究Hh和IGF信号通路在介导特立帕肽骨合成代谢作用中的角色。
三、 详细研究流程与方法 本研究采用了多层次的体内外实验结合单细胞转录组测序（scRNA-seq）的系统性研究策略。
流程一：验证特立帕肽对Gli1+ MMPs的体内效应 * 研究对象与样本量：使用转基因小鼠模型（Gli1-CreERT2; Ai9; Col1-GFP）。小鼠在1月龄时，连续3天给予他莫昔芬（Tamoxifen, Tam）以标记Gli1+细胞及其后代（表达tdTomato红色荧光蛋白），随后进行为期21天或3天的每日特立帕肽或载体注射。每组通常使用3只小鼠进行分析。 * 实验方法： 1. 长期效应评估：21天处理后，通过显微计算机断层扫描（μCT）定量分析股骨远端骨小梁的骨量（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、数量（Tb.N）和分离度（Tb.Sp）。通过骨组织冰冻切片，直接观察tdTomato（红色，标记Gli1谱系）和Col1-GFP（绿色，标记成熟成骨细胞）的荧光，定量统计干骺端初级骨松质区域的红色细胞总数及红绿共标（黄色）的成熟成骨细胞数量。 2. 短期效应与机制初探：3天处理后，在处死前注射EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）以标记增殖细胞。通过骨切片上的EdU检测（点击化学法）和Osterix（Osx，成骨细胞早期标志物）免疫荧光染色，分别定量分析Gli1谱系细胞中的增殖指数（EdU+%）和成骨分化比例（Osx+%）。同时使用TUNEL染色检测细胞凋亡。 3. 排除混淆因素实验：改变给药顺序，先给特立帕肽3天，再给Tam 3天或1天，以排除药物直接激活CreERT2系统的可能性，并直接评估对MMPs增殖的影响（通过EdU标记）。
流程二：通过单细胞RNA测序解析MMPs异质性并识别靶细胞群 * 研究对象与样本量：使用Gli1-CreERT2; Ai9小鼠。1月龄小鼠连续3天Tam标记后，再给予3天特立帕肽或载体注射，次日取材。每组5只小鼠（3雄2雌）。 * 实验方法： 1. 细胞分选：解剖股骨干骺端（去除生长板），胶原酶消化获得单细胞悬液。通过流式细胞术分选tdTomato+ CD45− Ter119− CD31− 细胞（即非造血、非内皮、Gli1谱系的基质细胞）。 2. 单细胞测序与数据分析：使用10x Genomics Chromium平台进行scRNA-seq。数据通过Cell Ranger流程处理（比对至mm10基因组）。使用Seurat软件包进行整合分析（CCA校正批次效应）、聚类（t-SNE和UMAP可视化）和差异基因表达分析。利用Monocle 3软件进行轨迹推断和拟时序分析，预测细胞分化关系。 3. 生物信息学分析：鉴定各细胞簇的特征基因（marker genes）。通过DAVID进行基因本体论（GO）和通路富集分析。重点关注Hh靶基因、特立帕肽受体（Pth1r）、IGF信号通路相关基因的表达模式，以及特立帕肽处理后的变化。
流程三：验证scRNA-seq发现的靶细胞群——软骨细胞样成骨祖细胞（COP） * 研究对象与样本量：使用Acan-CreERT2; Ai9（或结合Col1-GFP）小鼠。在4周龄时给予Tam标记，于标记后24小时或2周取材。 * 实验方法： 1. COP细胞鉴定：标记后24小时，通过免疫荧光共染色检测tdTomato+细胞是否共表达Runx2、Gli1等蛋白，确认其祖细胞特性。同时检测Sox9蛋白表达（此前研究发现mRNA表达但蛋白难检测）。 2. COP细胞命运追踪：标记后2周，通过观察tdTomato+细胞是否与Col1-GFP+成熟成骨细胞共定位，直接证明COP向成骨细胞的分化能力。 3. 特立帕肽对COP的作用：在Tam标记后，给予3天或7天的特立帕肽或载体处理。通过EdU标记和Osx免疫染色评估COP的增殖和早期分化；通过观察与Col1-GFP共标评估其产生成熟成骨细胞的能力。
流程四：探究Hh信号通路在介导特立帕肽效应中的作用 * 研究对象与样本量： 1. 遗传学模型：使用Gli1-CreERT2; Ai9; Ihh+/− 杂合子小鼠及其对照（Ihh+/+）。Ihh杂合缺失可部分降低Hh信号而不致死。 2. 药理学抑制：使用Gli1-CreERT2; Ai9小鼠，在Tam标记后，联合或不联合注射Smo抑制剂GDC-0449与特立帕肽3天。 3. 整体骨代谢评估：使用野生型小鼠，给予特立帕肽、GDC-0449或两者联合处理10天。 * 实验方法： 1. 对MMPs的影响：通过计数干骺端tdTomato+细胞数量、EdU+%和Osx+%，评估Ihh杂合缺失或药物抑制对MMPs扩增、增殖和分化的影响。 2. 对整体骨形成的影响：通过μCT分析胫骨近端骨小梁骨量；通过血清I型前胶原N端前肽（PINP）和I型胶原C端交联肽（CTX-I）水平分别评估骨形成和骨吸收活性；通过双荧光标记（钙黄绿素和阿利新红）计算胫骨内膜面的矿物沉积率（MAR），评估成骨细胞活性。
流程五：探究IGF信号通路在介导特立帕肽效应中的作用 * 研究对象与样本量：使用条件性基因敲除小鼠模型：实验组（CKO）为Gli1-CreERT2; Ai9; Igf1r c/c，对照组（Ctrl）为Gli1-CreERT2; Ai9; Igf1r c/+。在1月龄时给予Tam诱导MMPs中Igf1r基因敲除的同时进行谱系标记，随后进行3天（急性效应）或21天（长期效应）的特立帕肽或载体处理。 * 实验方法： 1. 对MMPs的急性效应：3天处理后，通过EdU和Osx免疫荧光染色，定量分析MMPs的增殖和分化比例。 2. 对整体骨形成的长期效应：21天处理后，通过μCT分析骨量，检测血清PINP和CTX-I水平。
四、 主要研究结果及其逻辑关系 结果1：特立帕肽在体内显著刺激Gli1+ MMPs的增殖和成骨分化，并扩大其细胞池。 21天特立帕肽处理不仅增加了干骺端骨小梁的骨量，还显著增加了该区域tdTomato+ Gli1谱系细胞的总数以及tdTomato+GFP+的成熟成骨细胞数量。短期（3天）处理实验进一步证实，特立帕肽提高了Gli1谱系细胞的EdU掺入率和Osx阳性率，但不影响其凋亡率。改变给药顺序的实验排除了药物直接激活Cre系统的可能性，并直接证明特立帕肽能促进MMPs自身增殖。这些结果首次明确了Gli1+ MMPs是特立帕肽在生长小鼠体内的关键细胞靶点之一。
结果2：scRNA-seq揭示MMPs高度异质性，并识别出一个对Hh信号响应最强、富含IGF通路成分且受特立帕肽调控的软骨细胞样成骨祖细胞（COP）簇。 对分选出的Gli1谱系细胞进行scRNA-seq，鉴定出四个主要细胞簇：成熟成骨细胞（OB）、前成骨细胞（PreOB）、COP和骨髓脂肪谱系祖细胞（MALP）。COP簇独特地高表达经典Hh靶基因（Gli1, Ptch1, Hhip）和IGF信号通路成分（Igf1r, Irs1, Irs2），同时表达特立帕肽受体Pth1r。特立帕肽处理后，COP细胞比例显著增加，且多个簇（包括COP）中Igf1r表达上调。轨迹分析预测COP可能分化为PreOB，进而产生OB或MALP。这一结果将特立帕肽的细胞靶点从宽泛的MMPs群体，精准定位到一个具有独特分子特征的亚群——COP。
结果3：谱系追踪实验证实COP是体内真正的成骨祖细胞，且特立帕肽直接刺激COP的增殖和成骨分化。 使用Acan-CreERT2小鼠特异性标记COP，发现标记后24小时，这些细胞共表达Runx2和Gli1蛋白。标记2周后，大量tdTomato+细胞与Col1-GFP+成熟成骨细胞共定位，直接证明了COP向成骨细胞的分化命运。给予特立帕肽后，COP细胞的增殖率（EdU+%）和早期分化比例（Osx+%）均显著提高，最终产生更多的tdTomato+GFP+成熟成骨细胞。此结果从遗传学角度验证了scRNA-seq的预测，并确立了COP作为特立帕肽直接作用的关键靶细胞。
结果4：Hh信号通路是特立帕肽刺激MMPs增殖和分化所必需的。 Ihh杂合缺失（Ihh+/−）完全阻断了特立帕肽引起的Gli1谱系细胞池扩增。使用Smo抑制剂GDC-0449不仅降低了MMPs的基础增殖和分化水平，而且完全消除了特立帕肽对这两方面的促进作用。在整体动物水平，GDC-0449抑制了特立帕肽引起的骨量增加和血清PINP水平升高，但不影响特立帕肽提升的矿物沉积率（MAR）。这表明Hh信号主要介导了特立帕肽刺激新生成骨细胞（来自MMPs/COP）的过程，而对现有成骨细胞活性的增强作用可能通过其他途径。
结果5：IGF信号通路在MMPs中介导了特立帕肽的成骨分化效应，并对其最佳骨合成代谢反应至关重要。 在MMPs中条件性敲除Igf1r，降低了其基础增殖和分化水平，并显著削弱了特立帕肽对分化的促进作用（存在显著的交互作用）。长期（21天）特立帕肽治疗下，Igf1r敲除小鼠的骨合成代谢反应（骨量增加和PINP升高）显著减弱。这些结果表明，IGF信号不仅是MMPs正常成骨所必需的，也是特立帕肽发挥最佳骨合成代谢作用的关键介质，且与特立帕肽信号在促进分化方面存在协同。
五、 研究结论与意义 本研究得出结论：在出生后生长的小鼠中，特立帕肽通过刺激Gli1+干骺端间充质祖细胞（MMPs）的增殖和成骨分化来促进骨形成。MMPs中存在一个独特的软骨细胞样成骨祖细胞（COP）亚群，该亚群高响应Hh和IGF信号，是特立帕肽的关键细胞靶点。特立帕肽的促增殖效应严格依赖Hh信号，而其促成骨分化效应则需要Hh和IGF信号的共同参与。
科学价值： 1. 阐明细胞靶点：首次在单细胞分辨率下明确了特立帕肽在生长骨骼中的直接靶细胞群——COP，深化了对骨合成代谢药物作用细胞基础的理解。 2. 揭示信号网络：阐明了Hh和IGF这两条在骨骼发育中至关重要的信号通路，在介导成人期药物性骨形成中的协同作用机制，连接了发育生物学与骨代谢药理学。 3. 解析细胞异质性：系统描绘了MMPs的细胞图谱，揭示了其内部从Hh高响应的COP到各类祖细胞和成熟细胞的谱系关系，为理解骨祖细胞库的构成和动态变化提供了新视角。
应用价值： 1. 药物研发：COP细胞及其依赖的Hh/IGF信号轴可作为筛选或优化新型骨合成代谢药物的潜在靶点。 2. 治疗策略：研究提示，联合或序贯使用针对这些通路的药物，或许能增强特立帕肽的疗效或开发替代疗法。 3. 机制理解：为理解特立帕肽在人体（尤其是生长后期或年轻成人）中促进骨形成的机制提供了重要的临床前模型和理论依据。
六、 研究亮点 1. 发现新颖细胞类型：鉴定并功能验证了“软骨细胞样成骨祖细胞（COP）”这一新的骨祖细胞亚型，其兼具软骨和成骨细胞分子特征。 2. 技术整合优势：巧妙地将经典的遗传学谱系追踪、体内药理学干预与前沿的单细胞转录组测序技术相结合，从现象到机制，从群体到单细胞，构成了完整证据链。 3. 机制研究深入：不仅验证了Hh和IGF通路的重要性，还通过遗传学和药理学双重手段，区分了它们在介导增殖和分化不同生物学效应中的具体作用。 4. 研究设计严谨：通过设计“先药后标记”等对照实验，有效排除了实验系统本身的干扰，确保了结论的可靠性。
七、 其他有价值内容 研究还发现了一些有趣的现象和观点：例如，特立帕肽诱导了所有MMPs衍生细胞簇中核糖体蛋白和氧化磷酸化相关基因的上调，提示药物可能普遍提高了靶细胞的蛋白质合成和能量代谢水平，这是一种广泛的合成代谢反应。此外，讨论部分提出，特立帕肽可能通过上调IGF1R来增强IGF信号，进而通过磷酸化激活Gli2来对抗PKA对Hh信号的抑制，从而净增加Hh信号输出，这为Hh与IGF信号如何整合特立帕肽信号提供了一个具体的分子假说模型，值得未来深入研究。