本研究由海德堡大学药学与分子生物技术研究所（IPMB）的Murat Sunbul、Andres Jäschke团队，联合卡尔斯鲁厄理工学院（KIT）应用物理研究所、纳米技术研究所、生物与化学系统研究所，以及伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校物理系的G. Ulrich Nienhaus、Karin Nienhaus等共同完成。论文以“brief communication”形式发表于 *Nature Biotechnology*，2021年2月11日在线发表，卷号为第39卷，页码686–690，DOI为10.1038/s41587-020-00794-3。

该研究属于RNA成像与超分辨荧光显微技术交叉领域。超分辨荧光显微镜为细胞生物学提供了突破衍射极限的空间分辨能力，但相比蛋白质标记工具，RNA的超分辨成像标记手段长期匮乏。近年来，荧光点亮适配体（fluorogenic light-up aptamers，FLAPs）被视作RNA成像的重要工具，然而此前报道的FLAPs大多仅适用于常规衍射受限成像；少数用于受激发射损耗显微镜（STED）或结构光照明显微镜（SIM）的适配体仍存在光漂白、信噪比不足或染料交换慢等问题。因此，开发一种具有快速染料结合-解离动力学、高亮度、高光稳定性且适用于单分子定位显微镜（single-molecule localization microscopy，SMLM）的RNA适配体，是该研究的核心目标。

研究流程可分为五个主要阶段。第一阶段为定向进化与理性设计（directed evolution and rational design）。研究以15%掺杂的SRB-2适配体文库为起始，利用指数富集的配体系统进化（SELEX）技术，以四甲基罗丹明（TMR）修饰的磁珠为诱饵，在降低TMR浓度和RNA浓度、增加洗涤次数的渐进筛选压力下进行七轮体外进化。每轮后通过洗脱RNA比例和TMR-DN荧光增强程度监测文库富集。深度测序与截短分析发现两个关键突变：在C6与U7之间插入单个U核苷酸，以及U22A突变，由此设计出SRB-3，其亮度较SRB-2提升50%，亲和力提高1.8倍（KD=20±1 nM）。为消除SRB-3预测存在的替代二级结构，研究者将U8-A19碱基对理性替换为C-G，并将UUCG四环替换为GAAA，最终获得RhoBAST（rhodamine-binding aptamer for super-resolution imaging techniques）。RhoBAST的正确折叠比例为86±5%，荧光点亮倍数为26倍，KD为15±1 nM。

第二阶段为光物理与动力学表征。圆二色光谱表明SRB-2、SRB-3和RhoBAST结构相似。RhoBAST:TMR-DN复合物的荧光不依赖Na⁺或K⁺，但严格依赖Mg²⁺浓度；在0.25 mM Mg²⁺条件下仍保持90%以上最大荧光，表明其在生理条件下可有效工作。激发和发射峰分别为564 nm和590 nm，亮度分别是Broccoli:DFHBI-1T的4.6倍、Corn:DFHO的7.6倍，与Pepper:HBC620相当。熔解温度为79 °C，具有极高热稳定性。在持续3小时、567 nm LED照射下，RhoBAST:TMR-DN仅光漂白1%，而JF549-Halo配体、mRuby3荧光蛋白和Pepper620分别衰减12%、40%和66%。单分子成像测得TMR-DN的解离速率系数kd=0.66±0.01 s⁻¹，结合速率系数ka=1.8±0.1×10⁷ M⁻¹s⁻¹，由此计算KD=37±3 nM，与溶液测定一致。平均结合停留时间为1.5 s，在10 nM染料浓度下约5 s内完成配体交换。这种快速可逆结合导致荧光持续闪烁，是实现SMLM的关键。

第三阶段为细菌中的衍射受限成像与灵敏度验证。将单个RhoBAST融合至GFP mRNA的3′非翻译区（UTR），在大肠杆菌中表达后，TMR通道信噪比达14±1，优于SRB-3（8±1）和SRB-2（4±1）。当串联重复数增至8个时，荧光强度呈近似线性增加；16个重复时仍保持期望值的70%。通过RT–qPCR定量，即使在每细胞约1个GFP-RhoBAST16 mRNA分子的表达水平下，TMR通道仍可检测到显著高于对照的荧光。利用基因组编辑将多个RhoBAST重复稳定整合到大肠杆菌K12基因组中，成功成像了内源性ompA、RNaseE和cat mRNA的不同定位模式。

第四阶段为哺乳动物活细胞与固定细胞成像。利用Tornado质粒系统在HEK293T细胞中表达环状RhoBAST，观察到其分布于细胞核斑点及胞质。将RhoBAST16标记的GFP mRNA在CAG启动子下表达，呈现典型胞质定位。表达含CGG三核苷酸重复的FMR1-GFP mRNA并融合RhoBAST16，在HeLa细胞中重现了该致病mRNA的核内聚集模式。单分子荧光原位杂交（smFISH）实验显示RhoBAST标记的mRNA与特异性探针高度共定位，Pearson相关系数为0.856，证明RhoBAST在smFISH流程后仍保持完整功能。RhoBAST标签未改变目标RNA定位，也不干扰核酸外切酶XRN1的降解。

第五阶段为SMLM超分辨成像。在大肠杆菌中，GFP-RhoBAST mRNA的SMLM图像成功分辨出单个适配体斑点，对六个斑点的强度剖面高斯拟合得到平均半高全宽（FWHM）73±5 nm，平均定位不确定度σ=32±7 nm；而GFP-Pepper因染料交换缓慢和光漂白快，无法获得有效SMLM图像。在HEK293T活细胞中，SMLM揭示核内环状RhoBAST形成空心球结构。免疫荧光共定位显示这些结构与NONO和PSPC1蛋白共定位，后者是旁斑（paraspeckle）核体的关键组分，提示环状RhoBAST在核内的高浓度可能促进RNA相分离、形成类旁斑核体。在细菌中，携带tolB信号肽的tolB-GFP-RhoBAST16 mRNA通过SMLM清晰显示其定位于细菌内膜，且因多重复合标签可在更少相机帧数下获得高质量图像；缺少tolB序列或携带非SRP依赖性信号肽的对照mRNA定位模式不同。smFISH与SIM验证了这些定位结果。此外，SMLM还揭示了HeLa细胞中(CGG)99-FMR1-GFP-RhoBAST16 mRNA聚集体的结构细节。双色成像中，TMR通道的SMLM图与远红通道的smFISH外荧光图像高度共定位。

该研究的核心结论是：RhoBAST是一种经过系统定向进化和理性设计获得的、特异结合荧光原性罗丹明染料TMR-DN的RNA适配体，具有极快的染料结合与解离动力学、极低的光漂白率、高亮度和高热稳定性。其快速可逆的染料交换使单分子定位不受光漂白限制，定位精度原则上仅受光子数统计约束。RhoBAST:TMR-DN系统是首个专门为活细胞SMLM开发的FLAP，能够在活细胞和固定标本中以约10 nm的定位精度和高信噪比成像RNA的亚细胞及亚核结构。

本研究的主要亮点包括：第一，RhoBAST是首个针对SMLM优化的荧光点亮RNA适配体，突破了此前FLAP在光漂白和染料交换动力学方面的限制；第二，该适配体通过SELEX定向进化和理性设计相结合获得，与母体SRB-2相比在折叠效率、热稳定性、亲和力、亮度和抗光漂白性方面均有显著提升；第三，RhoBAST在保持高信噪比的前提下，可在低至单拷贝水平检测目标mRNA，并支持多重复串联以增强信号；第四，SMLM成像揭示了核内类旁斑空心球结构及RNA聚集体细节，展示了其在RNA细胞生物学研究中的应用潜力；第五，RhoBAST兼容smFISH和免疫荧光等多重标记流程，为RNA的超分辨多色成像提供了新手段。

此外，该研究还系统报道了RhoBAST的合成、SELEX筛选流程、体外表征方法、细菌与哺乳动物细胞成像方案、单分子动力学测量装置及数据分析算法等技术细节，为其他实验室复现和拓展该工具提供了完整参考。