新型α,β-不饱和酰胺衍生物作为抗真菌药物的开发研究

该研究由Zhongzuo Yan、Qi Li、Xinyu Li、Huanlin Wang、Dongze Zhao、Hao Yu、Mengbi Guo、Yitong Wang、Xin Wang、Hang Xu、Yanhua Mou、Zhuang Hou以及Chun Guo等研究人员完成，并发表于《Journal of Medicinal Chemistry》期刊，2024年第67卷第12601-12617页。文章详细介绍了一种针对抗真菌耐药性的候选化合物的开发与优化流程，特别是具有潜力的新型α,β-不饱和酰胺衍生物及其药物开发过程。

研究背景及意义

侵袭性真菌感染（invasive fungal infections，以下简称IFIs）已成为全球性严峻的健康威胁，每年超过150万人因其致死。尤其是器官移植患者、接受癌症化疗者及免疫抑制患者更易受到影响。当前临床上可用的抗真菌药物如多烯类（polyenes）、唑类（azoles）、棘白菌素类（echinocandins）以及氟胞嘧啶（flucytosine）等选择较少，且长期使用易导致真菌耐药性问题加剧。

研究团队在前期工作中发现，香豆素修饰的唑类化合物A32对耐药性真菌表现出优良活性，但其在肝微粒体中的代谢稳定性较差，限制了进一步开发。本研究旨在以A32为先导化合物，通过结构优化设计新的药物分子，同时保留良好的抗真菌活性，尤其是抗耐药性。

研究设计与工作流程

1. 化合物设计与合成

研究利用开环和生物电子等排体（bioisosteric）的策略，将香豆素的内酯环替换为代谢稳定性更高的α,β-不饱和酰胺（α,β-unsaturated amide）。合成过程中，先通过几步反应生成中间体，再与不同类型的胺（包括脂肪胺和芳香胺）反应，获得了一系列α,β-不饱和酰胺类化合物（C01-C18）。此举旨在改善代谢稳定性，同时增强抗真菌活性。

2. 化学与光谱性能表征

以代表性的目标化合物C07进行核磁共振（NMR）及高分辨质谱（HRMS）分析，确认其分子结构；并对其他化合物进行了相应的谱图表征。

3. 体外抗真菌活性研究

依据CLSI M27-A3指南对新化合物进行抗真菌活性评价，包括对8种病原性及唑类耐药真菌的最低抑菌浓度（MIC）测试。实验以A32、氟康唑（fluconazole）和咪康唑（miconazole）为阳性对照。

4. 抗真菌机制研究

结合气相色谱-质谱法（GC-MS）分析菌株的甾醇组分，观察化合物对关键酶14α-去甲基化酶（lanosterol 14α-demethylase，CYP51）的抑制作用。此外，研究采用透射电子显微镜（TEM）观测化合物对真菌细胞形态和膜结构的影响。

5. 抗耐药性机制研究

研究目标化合物对药物外排泵（如CDR1、CDR2、MDR1等基因表达）与抗药性相关基因（如ERG11）的调控能力。同时观察化合物对生物膜形成的干扰效果，以及防止酵母-菌丝形态转换的作用。

6. 药代动力学及毒性评估

通过肝微粒体代谢稳定性试验和血浆稳定性试验，考察化合物代谢特性。进一步通过急性毒性和亚急性毒性实验评估化合物C07的毒性。此外进行了药代动力学研究，探索化合物的生物利用度等参数。

主要研究结果

1. 目标化合物合成与抗真菌活性： 新设计的C01-C18系列化合物表现出从中等到优异的抗真菌活性，其中C07和C18对多种唑类耐药菌株表现出极强的抗真菌效果（MIC范围为0.015-4 μg/ml），优于先导化合物A32。

2. CYP51抑制与甾醇组成变化： 氟康唑、C07及C18处理后菌株的麦角固醇含量显著下降，与之相应，甲基化甾醇（如羊毛甾醇）含量增加，表明化合物通过CYP51抑制途径起效。

3. 细胞膜破坏与形态改变： 对比未处理对照组，C07和氟康唑处理的菌细胞膜损伤显著，且显示内容物泄漏等结构性变化。证实C07目标作用部位位于细胞膜，作用靶点为CYP51。

4. 抗耐药机制： C07与C18显著下调抗药性基因（ERG11、CDR1等）表达，同时干扰酵母-菌丝形态转换并抑制生物膜形成。RT-PCR分析表明，C07与C18能削弱相关转录因子的表达（如EFG1、CPH1）。

5. 药代动力学和毒性： C07较先导化合物A32展现出显著提高的代谢稳定性（肝微粒体t1/2=60.3分钟，A32=15.2分钟）及优越的血浆稳定性。在急性毒性实验中，1000 mg/kg剂量下小鼠未出现异常；亚急性毒性试验中，100 mg/kg连续给药未观察到显著炎症或器官损伤。

6. 体内抗真菌疗效： 在小鼠侵袭性念珠菌感染模型中，C07能大幅降低肾脏真菌负荷，并延长感染小鼠的生存期（14天），优于氟康唑。

研究结论

本研究设计并合成了新型α,β-不饱和酰胺衍生物，通过实验验证了其针对唑类耐药真菌的强效活性及良好的代谢稳定性。C07在抗真菌活性、抗耐药性以及体内疗效方面表现突出，具有作为抗耐药念珠菌病治疗药物候选化合物的潜力。

研究亮点

• 以结构优化方法克服先导化合物代谢限制，提供新颖的药物分子结构。
• 展现全面的抗耐药机制，包括打破生物膜防御及调控抗药相关基因。
• 系统评估C07在体内外的药物特性并验证其治疗潜力。

展望

该研究为开发抗真菌耐药新药提供了新思路，并提出了具有实际应用价值的候选化合物。后续研究可进一步优化化合物药代动力学特性，同时进行大规模临床前研究以推进药物上市进程。