本文为类型a，即单一原创研究的学术报告。
本文的主要作者包括Andreas Schulte、Janik Brockmann、Nina Müller、Tibor Anderlei以及通讯作者Jochen Büchs。研究团队主要来自德国亚琛工业大学生化工程研究所（AVT – Biochemical Engineering, RWTH Aachen University）、Kuhner Shaker GmbH和Kuhner AG。该研究于2025年发表于*Journal of Biological Engineering*，文章DOI为10.1186/s13036-025-00480-5。
研究背景
在生物技术开发过程中，摇瓶（shake flask）因其成本低、操作简便而被广泛用于菌种筛选、培养基优化、过程开发以及生产预培养。然而，与大规模发酵罐相比，摇瓶规模的在线过程分析工具（process analytical technology, PAT）长期以来较为匮乏，限制了从每次培养中获取信息的能力。近年来，虽然光密度、pH、荧光、溶解氧张力（dissolved oxygen tension, DOT）等在线测量技术已逐步应用于摇瓶和微孔板培养，但呼吸活动在线监测，尤其是尾气分析（off-gas analysis），仍然具有重要意义。尾气分析能够非侵入性地提供氧传递速率（oxygen transfer rate, OTR）、二氧化碳传递速率（carbon dioxide transfer rate, CTR）和呼吸商（respiration quotient, RQ）等绝对值，这些参数可用于物料衡算、代谢状态判断和过程放大。该研究的目的是开发一种名为“传递速率在线测量系统”（Transfer rate Online Measurement, TOM）的新型尾气分析装置，主要用于表面通气式生物反应器（尤其是摇瓶）中OTR、CTR和RQ的在线测量，以满足并行化、低成本、耐摇动、占地小以及高精度等需求。
研究流程与实验方法
TOM系统的测量原理基于此前已建立的RAMOS（Respiration Activity Monitoring System）技术，即在摇瓶培养过程中周期性停止通气，在封闭的测量阶段内通过检测顶空气体中氧气分压的下降和二氧化碳分压的上升来计算OTR和CTR。与RAMOS不同，TOM对传感器布置方式和CO₂检测技术进行了重要改进。研究团队首先比较了差压传感器（differential pressure sensor, Δp sensor）和非色散红外CO₂传感器（non-dispersive infrared CO₂ sensor, NDIR CO₂ sensor）在CTR测量中的性能。他们使用了一种改良的TOM系统，同时安装两种传感器，并在同一摇瓶上进行比较。实验中以酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）和氧化葡糖杆菌（*Gluconobacter oxydans*）为模型微生物，分别代表高CO₂生成和低CO₂生成的培养体系。结果显示，在低呼吸活动条件下，NDIR CO₂传感器比Δp传感器具有更高的分辨率和稳定性，因此最终TOM系统采用了NDIR CO₂传感器进行CTR测量。
随后，研究团队比较了两种气体出口设计：一种是带有出口阀的封闭系统，另一种是开放通气孔（open vent hole）系统。由于摇瓶在测量阶段并非完全封闭，当RQ大于1时，摇瓶内会产生向外气流；当RQ小于1时，外部空气会被吸入。为此，作者在原有氧和CO₂平衡方程的基础上引入了对流项（convective flow）校正。实验表明，在补偿了通过通气孔的对流后，开放通气孔设计与出口阀设计在OTR和CTR测量结果上没有明显差异，因此最终TOM系统采用开放通气孔设计，从而避免了出口阀堵塞或密封性差的问题。
最终TOM系统的结构如图1所示。摇瓶通过自吸式微泵主动通气，气体从培养箱内吸入，经进气阀进入摇瓶。同时，一个循环泵以约15 ml/min的流量持续从摇瓶顶空抽取气体，经过NDIR CO₂传感器和电化学O₂传感器后返回摇瓶。传感器、泵和电子元件安装在摇床柜顶部，不随摇瓶一起摇动，从而提高了系统鲁棒性并减少了传感器损坏风险。摇瓶出口为直径1.6 mm、长50 mm的开放通气孔，用作环境空气的扩散屏障。测量周期通常包括6分钟的测量阶段、1分钟的冲洗阶段和13分钟的通气阶段，循环重复进行。
为了评估TOM系统的准确性、精密度和重现性，研究团队采用了一种非生物校准方法。他们通过质量流量控制器向摇瓶内通入一定流量的O₂耗尽且CO₂富集的气体（如17% O₂/4% CO₂或5% O₂/16% CO₂），以模拟已知的OTR和CTR设定值（OTR_set和CTR_set）。实验设置了从0到约57 mmol/L/h的不同呼吸速率梯度，每个条件使用8个摇瓶，每个摇瓶重复测量4次。通过比较TOM测量值与设定值之间的偏差来评估准确性，通过多次测量的标准差来评估精密度。此外，还评估了测量阶段时长（t_meas）和装液量对测量分辨率的影响。
研究还对三种微生物模型系统进行了实际培养验证。S. cerevisiae DSM70449在含20 g/L葡萄糖的YEP培养基中培养，用于比较Δp传感器和NDIR CO₂传感器。G. oxydans 621H Δhsdr在含80 g/L甘露醇的Jülich培养基中培养，用于展示OTR、CTR和RQ在不同氧限制条件下的变化。Escherichia coli Tuner菌株在含7.5 g/L甘油的Wilms-MOPS矿物培养基中培养，并在不同OTR水平下用阿拉伯糖诱导重组蛋白表达，以展示TOM系统在监测代谢转换和蛋白表达过程中的应用潜力。
主要结果
在传感器比较实验中，*S. cerevisiae*培养的CTR最高可达35 mmol/L/h（25 mL装液量）。在高CTR水平（>10 mmol/L/h）下，Δp传感器和NDIR CO₂传感器的测量结果基本一致；但在低呼吸活动阶段，Δp传感器出现了明显波动，而NDIR CO₂传感器保持了稳定。在*G. oxydans*培养中，CTR最大值仅为约16 mmol/L/h（10 mL装液量），Δp传感器波动更加明显，这些波动被归因于环境温度和压力变化的影响，而NDIR CO₂传感器则表现出更平稳的测量曲线。这表明NDIR CO₂传感器在低CO₂分压下具有更高的灵敏度，更适合低呼吸活动培养的CTR监测。
在开放通气孔与出口阀的比较实验中，当补偿了通气孔对流后，两种设计在*S. cerevisiae*和*G. oxydans*培养中的OTR和CTR结果均无显著差异。然而，如果忽略对流项，OTR在RQ>1阶段会被高估，在RQ阶段会被低估。对CTR的影响相对较小，因为CO₂的浓度远低于O₂，对流引起的CO₂摩尔流较小。因此，采用NDIR CO₂传感器并结合对流补偿后，摇瓶出口可以设计为开放通气孔，从而简化了系统结构并提高了操作可靠性。
在性能评估中，TOM系统在整个测试范围内（OTR和CTR为0–57 mmol/L/h）测得的OTR和CTR均位于设定值的+0%至-5%范围内。这一系统性负偏差被认为主要来自实验装置本身的误差，例如质量流量控制器的精度或摇瓶气体体积的轻微低估。由于OTR和CTR连接到同一摇瓶，RQ值可用于评估测量准确性。实验表明，在测试范围内，平均RQ值在设定值的±4%以内，不同摇瓶之间的RQ标准差为±2%，表明系统具有良好的准确性和重现性。在精密度方面，测量阶段持续时间越长，OTR和CTR的标准差越小。在环境CO₂水平（约0.04%）下，CTR的标准差可低于0.02 mmol/L/h，这是此前在小规模摇瓶生物反应器中未报道过的高分辨率。在5% CO₂条件下，CTR标准差约为低CO₂条件下的10倍，这与NDIR传感器在高CO₂浓度下分辨率下降的特性一致。
在*G. oxydans*培养中，TOM系统成功捕捉到了氧限制（oxygen limitation）引起的OTR平台期以及碳源耗尽时的OTR和CTR急剧下降。RQ值在氧限制条件下从约0.1逐渐上升至约0.3的平台，表明代谢状态发生了变化。通过总耗氧量和总CO₂生成量结合化学计量模型，研究者预测了甘露醇消耗和果糖生成，预测值与HPLC离线测量值高度吻合，展示了尾气分析在定量代谢分析中的潜力。
在E. coli Tuner蛋白表达实验中，TOM系统清晰记录了不同诱导时间点下的OTR、CTR和RQ变化。在阿拉伯糖诱导后，OTR和CTR的上升速率因代谢负担（metabolic burden）而减缓。当阿拉伯糖耗尽后，代谢重新转向剩余的甘油，OTR和CTR出现明显拐点。RQ在诱导前约为0.67，与甘油氧化代谢相符；诱导后RQ逐渐上升至约0.85，表明甘油和阿拉伯糖同时被消耗。更重要的是，RQ在诱导后约20分钟才明显上升，暗示细胞从甘油代谢切换到阿拉伯糖代谢并启动重组蛋白表达需要一定时间。与RAMOS系统获得的对照数据相比，TOM系统在CTR和RQ测量中噪声更低，能够更清晰地区分不同代谢阶段。
结论与意义
本研究成功开发了TOM系统，这是一种基于RAMOS原理但经过多项改进的摇瓶尾气分析装置。TOM系统采用旁路设计将传感器安装在非摇动区域，结合NDIR CO₂传感器和开放通气孔设计，提高了系统的鲁棒性、分辨率和使用便利性。该系统能够在0–57 mmol/L/h的范围内同时测量OTR、CTR和RQ，RQ准确度在±4%以内，CTR分辨率在环境CO₂水平下低于0.01 mmol/L/h。该系统在微生物、哺乳动物细胞和植物细胞培养中均具有应用潜力，尤其适用于低呼吸活动培养的在线监测。
TOM系统的主要亮点在于：第一，采用旁路设计使传感器和电子元件不随摇瓶摇动，大幅提高了设备在强烈摇动环境下的稳定性和使用寿命；第二，用NDIR CO₂传感器替代传统RAMOS中的差压传感器，显著提高了低呼吸活动下的CTR测量分辨率和抗环境干扰能力；第三，通过引入对流补偿，实现了无需出口阀的开放通气孔设计，简化了系统结构并避免了出口阀故障；第四，TOM系统具有高度灵活性，可通过更换不同规格的盖子适配不同尺寸和类型的摇瓶，且测量分辨率可通过调整测量阶段时长进行调节。
此外，研究还展示了OTR和CTR数据在定量代谢分析中的应用，例如通过化学计量模型从总耗氧量和总CO₂生成量推算底物消耗和产物生成。这为生物过程开发中的培养基优化、菌株筛选、诱导策略优化以及代谢转换识别提供了有力工具。总体而言，TOM系统为摇瓶规模的高精度呼吸活动在线监测提供了一种新颖、可靠且灵活的解决方案，具有重要的科学价值和应用前景。