本研究的主要作者包括李晓勇（Xiaoyong Li）、郑曼（Man Zheng）、徐波（Bo Xu）、李大立（Dali Li）、沈跃（Yue Shen）、聂永强（Yongqiang Nie）、马莲（Lian Ma）和吴际（Ji Wu）。研究团队主要来自上海交通大学医学院仁济医院、Bio-X研究院、发育与神经精神疾病遗传学教育部重点实验室、华东师范大学生命科学学院、上海市调控生物学重点实验室、宁夏医科大学教育部生育力保持重点实验室以及深圳市儿童医院血液肿瘤科。该研究成果发表于2021年的生物材料领域期刊《Biomaterials》第279卷上，文章于2021年10月21日在线发表。
本研究的学术背景属于生殖医学、发育生物学和生物材料学的交叉领域，尤其聚焦于女性生殖系统再生医学与毒理学检测模型构建。研究的动因源于当前生殖健康领域面临的严峻挑战：包括卵巢早衰发病率上升、癌症放化疗导致的女性不孕症问题日益突出，以及全球范围内不孕不育夫妇比例高企。此外，传统的药物毒性检测模型存在局限性，如二维细胞培养无法模拟体内复杂的三维（3D）微环境和细胞间相互作用，而动物模型则存在物种差异、成本高昂和难以实时观察等问题。在基础研究层面，虽然已有研究利用胚胎干细胞或诱导多能干细胞在体外模拟卵子发生，但这些方法面临着伦理争议、潜在致癌风险以及技术复杂性等挑战。近年来，女性生殖系干细胞（Female germline stem cells， FGSCs）的发现为卵巢功能再生研究提供了新的契机。FGSCs是卵巢中具有自我更新和分化潜能的成体干细胞，理论上可以作为构建具有生理功能卵巢组织的理想种子细胞。因此，本研究旨在利用FGSCs，结合三维（3D）培养技术，开发一种能够模拟卵巢结构和功能的类器官模型，并验证其在产生功能性卵子（用于获得后代）以及进行药物毒理学检测方面的双重应用潜力。具体目标包括：1）建立并表征源自FGSCs的三维卵巢类器官；2）分析该卵巢类器官的细胞组成和内分泌功能；3）验证由该卵巢类器官产生的卵子具备发育为健康后代的能力；4）探索该卵巢类器官作为新型药物毒性筛选平台的有效性。
本研究的工作流程详尽且环环相扣，主要包括以下几个核心步骤。首先，是FGSCs细胞系的建立与鉴定。研究团队从表达Oct-4/EGFP的转基因小鼠卵巢中分离FGSCs，采用两步酶解法结合MVH（DDX4）抗体磁珠分选技术富集生殖细胞，随后在经丝裂霉素处理的STO饲养层细胞上进行培养扩增。建立了至少3个独立的FGSCs细胞系，并持续传代培养超过2个月。通过逆转录PCR（RT-PCR）检测了生殖细胞标志物（如Dazl, Mvh, Stella, Fragilis, Pou5f1, Blimp1）的表达，并通过免疫荧光染色确认了细胞同时表达EGFP和MVH蛋白，从而验证了所培养细胞的生殖细胞特性。
其次，是三维卵巢类器官的构建与培养。这是本研究方法的核心创新点。研究人员将已建立的FGSCs与来自胚胎期12.5天（E12.5）至出生前的雌性性腺体细胞混合，包埋于Matrigel基质胶中，接种于低吸附性的96孔U型底板中，使用特定的3D启动培养基培养2-3天。随后，将形成的细胞团转移至Transwell膜上，更换为α-MEM基础培养基继续培养。在第4天，培养基更换为StemPro-34基础培养基。在培养的第7至10天，加入了浓度为800 nM的雌激素受体拮抗剂ICI182780，以促进生殖细胞进入减数分裂。从第11天起，撤去ICI182780，继续使用StemPro-34基础培养基进行长期培养。整个过程在35°C、5% CO2的条件下进行，每两天更换一半体积的培养基。此流程建立了一套优化的、分阶段的体外卵巢发育模拟系统。
第三，是卵巢类器官的表征与分析。这一部分运用了多种技术手段进行多层次验证。形态与功能表征：在整个培养过程中，通过荧光显微镜动态观察类器官中EGFP阳性细胞（即源自FGSCs的细胞及其后代）的分布和形态变化，确认类器官内形成了包含卵母细胞的卵泡样结构。通过免疫组织化学染色，检测类器官卵泡中卵母细胞特异性标志物MVH和GDF9的表达。通过酶联免疫吸附测定或化学发光法检测培养基中雌二醇和孕酮的激素水平，评估类器官的内分泌功能。通过定量实时PCR检测类器官发育过程中减数分裂相关基因（如Stra8, Sycp3, Zp1, Zp2）以及类固醇合成关键酶基因（Cyp19a1, Cyp11a1）的表达动态。通过免疫荧光检测减数分裂染色体联会标志蛋白SYCP3和磷酸化组蛋白H2AX，观察卵母细胞减数分裂进程。单细胞转录组测序分析：为了深入解析类器官的细胞异质性，研究对培养21天的卵巢类器官进行了10x Genomics平台单细胞RNA测序。共分析了16，875个单细胞。数据分析采用Seurat软件包进行：包括数据质控过滤、归一化、主成分分析降维，然后基于前25个主成分进行t-SNE和UMAP聚类分析，最终识别出21个细胞簇。通过寻找每个细胞簇的特征表达基因，将其注释为不同的卵巢细胞类型，如生殖细胞、颗粒细胞、膜细胞、内皮细胞、免疫细胞和基质细胞等。并对不同细胞簇进行了基因本体论富集分析，以揭示其生物学功能特征。生殖细胞群维持的验证：通过流式细胞术检测类器官中EGFP阳性细胞与DNA合成标记EdU的双阳性比例，以评估其中是否存在增殖活跃的生殖细胞（即FGSCs）。此外，还研究了不同浓度抗坏血酸对类器官中生殖细胞比例的影响，以探索优化培养条件。
第四，是由卵巢类器官产生后代的验证。这是证明类器官功能完整性的关键步骤。研究人员从培养成熟的卵巢类器官中机械分离出卵泡，将其置于含有BMP15和GDF9等生长因子的3D卵泡培养液中进行体外生长培养约2周，促进卵泡发育为包含未成熟卵母细胞的卵丘-卵母细胞复合体。随后，将这些未成熟卵母细胞进行体外成熟培养17-20小时，获得成熟的MII期卵母细胞。接着，使用野生型ICR雄鼠的精子进行体外受精，并将发育至2-细胞期的胚胎移植到假孕雌鼠的输卵管中。最终，对出生的后代进行基因型鉴定（通过Southern blot检测EGFP基因）、体重监测、DNA甲基化模式分析以及繁殖力测试，全面评估后代的健康状况。
第五，是卵巢类器官在药物毒理学检测中的应用。研究选择抗生素类抗癌药物盐霉素作为模型药物进行测试。体内实验：对6周龄雌性ICR小鼠腹腔注射盐霉素，评估其对卵巢组织形态和卵泡数量的影响。二维细胞实验：用不同浓度盐霉素处理培养的FGSCs，通过CCK-8检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡。三维类器官实验：在卵巢类器官培养过程中加入盐霉素，观察其对类器官形成、卵泡数量、生殖细胞比例以及减数分裂相关基因表达的影响，并通过流式细胞术检测类器官细胞的凋亡情况。通过比较体内、二维和三维模型的结果，验证类器官模型在预测药物生殖毒性方面的可靠性。
本研究的主要结果丰富且有力地支持了研究目标。在FGSCs建立与类器官构建方面，成功建立了可长期传代的FGSCs细胞系，并基于此构建了三维卵巢类器官。类器官在培养过程中逐渐形成清晰的卵泡样结构，其中卵母细胞表达MVH和GDF9。激素检测显示，随着培养时间延长，培养基中雌二醇和孕酮水平显著持续上升，同时类固醇合成关键酶基因表达上调，证明了类器官具有类似体内卵巢的内分泌功能。单细胞转录组测序结果揭示了类器官的高度复杂性，成功鉴定出包括生殖细胞、颗粒细胞、膜细胞在内的六种主要卵巢细胞谱系，其基因表达特征与体内卵巢细胞高度相似。对生殖细胞簇的基因富集分析发现了“干细胞群维持”等条目，暗示类器官中可能存在未分化的FGSCs。流式细胞术证实了类器官中存在增殖性生殖细胞（EGFP+/EdU+），且适宜浓度的抗坏血酸处理有助于维持类器官中的生殖细胞比例，这为类器官的长期培养和功能维持提供了线索。在后代产生方面，从类器官中共获得1140枚未成熟卵母细胞，平均每个类器官产生31.67枚。这些卵母细胞经体外成熟和体外受精后，受精率（49.9%）与对照组（46.2%）无显著差异。胚胎移植后成功获得了51只健康的纯黑色后代（源自表达EGFP的供体细胞）。Southern blot证实后代携带EGFP转基因，且后代在体重、DNA甲基化模式和繁殖力方面均与野生型小鼠无异，这强有力地证明了由FGSCs来源的卵巢类器官能够产生具备完全发育潜能的、可育的功能性卵母细胞。在毒理学检测应用方面，盐霉素的体内实验表明其导致小鼠卵巢重量减轻、卵泡数量减少、闭锁卵泡增加。体外实验显示盐霉素能剂量依赖性地抑制FGSCs的活力和增殖，并诱导其凋亡。更重要的是，在三维卵巢类器官模型中，盐霉素处理同样导致了卵泡数量显著减少、类器官中生殖细胞比例大幅下降、减数分裂相关基因表达下调，并显著诱导了细胞凋亡。这些结果表明，盐霉素通过诱导细胞凋亡损害了卵巢类器官的形成和生殖细胞的维持。三维类器官模型的结果与体内实验结果高度一致，验证了该模型在模拟药物体内毒性方面的有效性。
本研究的结论是，首次利用雌性生殖系干细胞成功构建了具有生殖和内分泌功能的三维卵巢类器官模型。该模型不仅能够在体外产生可育后代的功能性卵母细胞，为辅助生殖技术和女性生育力保存提供了新的潜在卵源；而且能够有效地用于药物的生殖毒性筛选和机制研究，为药物开发提供了一个更接近人体生理状态的新型、可靠的体外测试平台。
本研究的亮点和重要性体现在多个方面。科学发现层面：首次实现了从成体干细胞（FGSCs）来源的卵巢类器官中产生健康可育的后代，这是生殖生物学和再生医学领域的一项重大突破。技术创新层面：1）建立了一套优化的、分阶段的FGSCs三维类器官诱导培养体系；2）首次对卵巢类器官进行了全面的单细胞转录组图谱分析，系统揭示了其细胞组成和分子特征；3）将类器官技术创造性地应用于生殖毒性检测领域，证明了其在该应用中的可行性和优势。模型优势层面：与胚胎干细胞或诱导多能干细胞来源的模型相比，FGSCs来源于成体组织，规避了伦理争议和潜在致瘤风险；与传统的二维细胞模型相比，三维类器官更好地模拟了卵巢的组织结构、细胞间相互作用和生理功能；与动物模型相比，类器官模型更经济、高效，且便于进行机制研究和高通量筛选。应用价值层面：该研究不仅为理解卵巢发育和卵子发生提供了新的研究工具，也为女性不孕症的治疗（如开发“人工卵巢”）、生育力保存、以及药物（特别是抗癌药物）的生殖安全性评估开辟了新的途径。
此外，研究中对盐霉素生殖毒性的详细探究本身也具有重要价值。盐霉素作为一种有潜力的广谱抗癌药物，其生殖系统副作用此前在雌性系统中的研究相对较少。本研究通过体内外结合的方式，明确揭示了盐霉素对卵巢组织和卵泡发育的损害作用及其可能通过诱导凋亡实现的机制，这对于该药物的临床安全应用具有重要的警示和参考意义。这项研究是一项集基础研究、技术创新和转化应用于一体的优秀范例，为生殖医学和毒理学研究领域贡献了一个极具价值的模型系统。