本研究由Eric Y. Du、H. T. Kim Duong、M. A. Kristine Tolentino、Jacinta L. Houng、Panthipa Suwannakot、Kristel C. Tjandra、Duyen H. T. Nguyen、Richard D. Tilley以及J. Justin Gooding等人完成，主要来自新南威尔士大学化学学院和澳大利亚纳米医学中心。该研究于2025年2月19日在线发表在Macromolecular Research期刊上，属于原创性研究论文。
研究背景方面，三维（3D）细胞培养相较于传统二维（2D）培养能够更准确地模拟体内微环境，而水凝胶因其多孔网络和纤维结构与天然细胞外基质（ECM）相似，成为理想的ECM模拟材料。天然来源的ECM模拟物如胶原蛋白和明胶具有优异的生物活性，但缺乏可调控性；合成ECM模拟物虽然结构明确、力学性能可调，但即便经过修饰，其生物活性仍不如天然蛋白质。因此，本研究旨在结合天然与合成材料的优势，开发一种生物杂化（biohybrid）离子交联明胶水凝胶，既具备天然明胶的生物活性，又具备合成聚合物的力学可调性和可控降解性。
研究的工作流程主要包括以下几个步骤。第一步是量化明胶中伯胺含量。研究者使用茚三酮（ninhydrin）法，以甘氨酸为标准品建立标准曲线，检测了冷水鱼、猪皮和牛皮肤来源的明胶中伯胺浓度，结果分别为1.63×10⁻⁴、3.33×10⁻⁴和3.69×10⁻⁴ mol/g。牛来源明胶因伯胺含量最高而被选为进一步修饰的候选材料。第二步是合成4-氰基-4-(苯基碳硫酰硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺酯（CPADB）修饰的明胶。在碱性磷酸盐缓冲液（PBS，pH 10）中，明胶骨架上的伯胺与CPADB的羰基发生氨解反应，反应在40°C搅拌24小时，经透析和冻干后得到粉红色固体产物（gel-CPADB），产率50%。核磁共振氢谱（¹H NMR）在7.5 ppm处出现的苯基峰证实了CPADB的成功偶联。第三步是通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合反应合成3-磺丙基甲基丙烯酸酯修饰的明胶。将gel-CPADB与3-磺丙基甲基丙烯酸钾盐（SPMA）以及引发剂4,4’-偶氮双(4-氰基戊酸)（ACVA）溶解于水中，在氩气保护下70°C搅拌48小时。通过调整SPMA单体的摩尔当量和反应时间，成功合成了臂长为15、30和45个重复单元（repeating units, RU）的明胶-SPMA（gelatin–SPMA）。¹H NMR谱中2.9 ppm处的亚甲基峰证实了SPMA链的存在，并通过与7.5 ppm处芳香峰的面积比较确定了链长。第四步是合成带正电的聚乙二醇（PEG）交联剂。根据文献报道的方法，将20 kDa三臂PEG-NH₂与CPADB-NHS反应得到PEG-CPADB，再通过RAFT聚合接枝[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]三甲基铵（MAETMA）单体，单体转化率为60%，每条臂约150个重复单元，形成PEG-MAETMA。第五步是水凝胶的形成。将gelatin–SPMA和PEG-MAETMA分别溶解在DMEM培养基中，浓度为10% w/v，等体积混合后，带负电的SPMA与带正电的MAETMA通过静电相互作用在20秒内形成离子交联水凝胶。值得注意的是，未接枝SPMA的gel-CPADB与PEG-MAETMA混合不能成胶，且gelatin–SPMA溶液本身在10% w/v浓度下也不能成胶，说明离子交联是凝胶形成的主要驱动力。这可能是由于CPADB偶联反应的碱性条件使明胶主链断裂成更小、更易溶解的片段。
在表征和细胞实验中，流变学测试在37°C下进行，包括时间扫描、频率扫描和应变扫描。储能模量（G’）随臂长增加而增大，15、30和45 RU的储能模量分别为23、97和281 Pa，换算成杨氏模量分别为67、281和815 kPa，落在文献报道的乳腺组织杨氏模量范围内。所有凝胶的损耗角正切（tan δ）均小于1，表明材料具有凝胶特性，其中45 RU的tan δ显著低于15和30 RU。此外，流变学测试还表明该生物杂化水凝胶在37°C下保持热稳定，而未功能化的明胶在37°C下不能保持凝胶状态，说明离子交联提供了在生理温度下的稳定性。
细胞实验使用MCF-7乳腺癌细胞。在AlamarBlue增殖实验中，将细胞以每毫升500万个的密度包封在15、30和45 RU的gelatin–SPMA水凝胶中，在第1、3、7天检测荧光。结果显示细胞在7天内增殖至初始值的四倍，且不同臂长条件之间无显著差异。活/死染色（Live/Dead assay）在第7天进行，Calcein AM染色活细胞呈绿色，乙锭同二聚体-1（EthD-1）染色死细胞呈红色，结果显示绝大多数细胞存活，与AlamarBlue结果一致，证实该水凝胶支持细胞生长和增殖。
在细胞球体形态分析中，将MCF-7细胞在gelatin–SPMA水凝胶中培养7天后测量细胞球的大小和形态，并与不含明胶的纯PEG聚电解质凝胶进行对比。纯PEG水凝胶通过RAFT反应合成SPMA臂长为150重复单元的聚电解质。结果显示，在15、30和45 RU gelatin–SPMA凝胶中形成的球体面积中位数分别为12.5×10³、11.2×10³和22.9×10³ μm²，而纯PEG凝胶中仅为4.5×10³ μm²；周长中位数分别为409.2、392.6和554.1 μm，纯PEG凝胶为249.5 μm。生物杂化明胶凝胶中的球体显著大于纯PEG凝胶，表明明胶的偶联促进了细胞间相互作用和球体形成。45 RU条件下球体最大，可能因其刚度最接近乳腺组织。在圆度和实心度方面，各条件下无显著差异，说明明胶片段化并未影响其支持细胞生长的能力。统计分析采用Kruskal-Wallis检验，显著性水平设为p<0.0001。
细胞回收实验利用了离子交联的可逆性。第7天时，将10×磷酸盐缓冲液（PBS）加入水凝胶中，轻轻吹打10秒即可使凝胶解离，释放包封的细胞球体。随后立即将解离的凝胶转移至DMEM中以减少渗透压应激。活/死染色显示，释放的单个细胞大多死亡，这可能是由于10× PBS引起的高渗冲击；但完整的细胞球体在释放后仍保持活力，表现为大量绿色荧光。这一结果表明该方法可回收活细胞球体用于后续分析。
本研究的结论是，通过结合明胶的RAFT修饰和聚电解质离子交联策略，成功合成了一种生物杂化明胶-PEG水凝胶。该水凝胶具有可调的力学性能，其杨氏模量可通过改变SPMA臂长在软组织的范围内调节；在37°C下具有热稳定性，克服了天然明胶的热不稳定缺陷；支持MCF-7细胞增殖并形成比纯PEG凝胶更大的细胞球体；且可通过10×PBS快速降解以回收活细胞球体，便于下游分析。该研究的科学价值在于展示了天然与合成聚合物结合的策略，保留了明胶的生物活性片段，同时赋予材料合成聚合物所特有的可调性和可控降解性。其应用价值在于为三维细胞培养提供了一种更具ECM仿生能力的平台，有助于更准确地研究细胞行为，推动治疗开发和基础科学的发展。
本研究的亮点包括：开发了一步法将RAFT链转移剂偶联到明胶骨架上并进一步聚合形成聚电解质臂的合成路线；利用静电相互作用实现了快速凝胶化（20秒内）和温和的细胞回收；即使在明胶主链因碱性条件断裂的情况下，生物杂化水凝胶仍能保留明胶的生物学功能，促进MCF-7细胞球体形成；通过简单调节单体比例即可改变凝胶刚度，为模拟不同组织力学环境提供了便捷手段。