关于单饱和酸sn-1,3二酰基甘油纯化及其酰基迁移对结晶行为与物理性质影响的研究报告
一、 研究作者、机构及发表信息
本研究由暨南大学食品科学与工程系的Yilin Mao、Yong Wang、Zhen Zhang，马来西亚莫纳什大学（马来西亚校区）的Yee-Ying Lee，以及广东三比仑特殊医学用途配方食品有限公司的Jianqiang Cheng共同完成。该研究成果以学术论文形式发表，于2023年7月21日在线发表于食品科学与技术领域的国际期刊《LWT - Food Science and Technology》第184卷，文章编号为115105。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于食品科学、油脂化学与功能脂质领域。sn-1,3-二酰基甘油（sn-1,3 DAG）作为一种功能性脂质，因其独特的生理代谢途径（相较于sn-1,2异构体更为健康）和物理特性（如更高的熔点、可调节脂肪结晶行为以改善食品质构）而受到广泛关注。然而，高纯度的sn-1,3 DAG的制备面临挑战，因为传统的纯化方法（如分子蒸馏）可能因其高温过程而加剧sn-1,3 DAG向sn-1,2 DAG的酰基迁移（acyl migration）。此外，sn-1,3 DAG在储存或加工过程中也会自发发生酰基迁移，生成sn-1,2异构体，从而改变混合DAG的组成，进而显著影响其结晶行为、多晶型、晶体形态及最终产品的物理性质（如熔点、固体脂肪含量、质构）。尽管酰基迁移现象已知，但针对不同链长、在不同温度及分散体系下的酰基迁移动力学，以及迁移程度对DAG结晶行为和物理性质的系统性影响，研究尚不充分。
因此，本研究的目的是：1）开发一种高效、低温的混合溶剂结晶法，用于纯化合成的高纯度单饱和酸sn-1,3 DAG（以月桂酸DAG，LDAG和棕榈酸DAG，PDAG为模型）；2）系统研究温度及体系分散度对sn-1,3 DAG酰基迁移动力学的影响；3）深入探究不同酰基迁移程度（AMD）对纯化后DAG的结晶/熔化热行为、固体脂肪含量（SFC）、结晶动力学、晶体多晶型及形态的影响。最终，旨在为定制具有特定物理化学性质（如特定熔化范围、晶体网络结构）的高含量sn-1,3 DAG功能性油脂产品提供理论依据和实践指导。
三、 详细研究流程与方法
本研究流程清晰，主要分为四个核心部分：sn-1,3 DAG的合成与纯化、酰基迁移动力学研究、热性质与结晶动力学分析、以及晶体多晶型与形态表征。
1. sn-1,3 DAG的合成与纯化： * 合成： 采用sn-1,3特异性脂肪酶（Lipozyme TL IM）催化的甘油与乙烯酯的不可逆酯化反应，分别在25°C下反应5小时，合成了sn-1,3 LDAG和sn-1,3 PDAG的粗产品。使用乙烯酯而非游离脂肪酸是为了避免生成水，从而最大限度地减少合成过程中的酰基迁移。 * 纯化： 核心创新在于采用混合溶剂结晶法，以避免高温纯化导致的酰基迁移。研究者首先基于溶剂极性参数Et(30)筛选了单一溶剂（如正己烷、甲醇、乙酸乙酯），发现单一溶剂效果有限。进而系统研究了由低极性溶剂（正己烷）和高极性溶剂（甲醇或乙酸乙酯）按不同体积比组成的混合溶剂体系，考察了溶剂组成、结晶温度和结晶时间对纯化效果（纯度和得率）的影响。纯化效果通过气相色谱（GC-FID）分析酰基甘油组成（FFA、MAG、DAG、TAG含量），并通过核磁共振氢谱（¹H NMR）测定sn-1,3异构体比例来评估。最终确定了最优纯化条件：对于LDAG，使用正己烷:乙酸乙酯 = 92:8 (v/v)的混合溶剂，在5°C下结晶3小时，获得纯度97.8%的sn-1,3 LDAG；对于PDAG，采用两步法，先用正己烷:乙酸乙酯 = 98:2 (v/v)在15°C下结晶3小时，再用甲醇在-20°C下二次结晶，最终获得纯度98.3%的sn-1,3 PDAG。
2. 酰基迁移动力学研究： * 研究对象与处理： 使用上述纯化的sn-1,3 LDAG和PDAG作为起始材料。 * 实验设计： 研究了两个变量对迁移动力学的影响：(a) 温度： 将纯DAG样品分别在60°C、80°C、100°C和140°C的真空条件下加热，持续监测30小时。(b) 体系分散度： 在60°C下，将DAG与中链甘油三酯（MCT）以不同比例（1:1和10:1， w/w）混合，模拟油脂体系中的分散状态，研究MCT添加对迁移的促进作用。 * 监测方法： 定期取样，通过¹H NMR定量分析sn-1,3 DAG与sn-1,2 DAG的比例变化，计算酰基迁移度（AMD）。将迁移动力学视为一级反应，计算迁移速率常数（km）和半衰期（t1/2）。此外，在迁移达到约10%、20%和35% AMD时，取出样品，标记为10%AMD-DAG、20%AMD-DAG和35%AMD-DAG，用于后续结晶性质研究。
3. 热分析与结晶动力学研究： * 仪器与方法： 采用差示扫描量热法（DSC）进行非等温扫描。 * 实验流程： 对所有样品（纯sn-1,3 DAG及不同AMD的DAG）进行程序升降温：首先从25°C升至80°C以消除热历史，然后以-5°C/min降至-10°C，记录结晶曲线；再以5°C/min升温至80°C，记录熔化曲线。 * 数据分析： * 热力学参数： 从DSC曲线直接获取结晶和熔化的起始温度、峰值温度、焓值。 * 固体脂肪含量（SFC）： 通过对熔化曲线进行部分积分计算不同温度下的SFC。 * 结晶动力学： 将SFC随时间变化的数据（SFC比率）用Avrami方程进行非线性拟合，得到Avrami指数（n，反映成核与生长机制）和结晶速率常数（k），并计算结晶半时间（t1/2）。
4. 晶体多晶型与形态表征： * 样品制备： 将样品熔融后骤冷至-20°C，储存24小时以充分结晶，然后在25°C下进行测试。 * X射线衍射（XRD）： 使用X射线衍射仪在6°至30°（2θ）范围内扫描，通过特征峰位置（如4.15 Å对应α晶型，4.34 Å和4.02 Å对应β‘晶型，3.78 Å、3.72 Å等对应β晶型）鉴定样品的晶体多晶型。 * 偏光显微镜（PLM）： 使用偏光显微镜在25°C下观察并拍摄样品的晶体形态和聚集状态，并使用软件测量晶体尺寸。
5. 统计方法： 所有实验均进行三次重复，数据以平均值±标准差表示。采用方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验进行显著性分析（p < 0.05），使用SPSS 16软件处理。
四、 主要研究结果
1. 纯化结果： 成功建立了基于混合溶剂（正己烷/乙酸乙酯）结晶的高效纯化方法。该方法的关键在于通过调节混合溶剂的比例（从而控制总极性Et(30)），使其与目标产物sn-1,3 DAG的极性相匹配，同时最大化溶解杂质（FFA、MAG、TAG）。在优化的温和条件下（低温、短时），成功获得了高纯度的sn-1,3 LDAG（97.8%）和PDAG（98.3%），有效避免了传统高温方法可能引发的酰基迁移。
2. 酰基迁移动力学结果： * 温度影响： 升高温度显著加速酰基迁移。例如，sn-1,3 LDAG在60°C下的迁移半衰期（t1/2）为20.81小时，而在100°C时缩短至1.71小时，在140°C时仅为0.51小时。sn-1,3 PDAG在60°C下30小时内未观测到迁移，表明其需要更高的活化能；在80°C和100°C下，其迁移速率远低于同温度下的LDAG，这与长链DAG熔点更高、分子运动性更低有关。 * 分散度影响： 添加MCT（作为分散介质）极大地促进了酰基迁移。对于在60°C下本不迁移的sn-1,3 PDAG，加入等量MCT后，迁移得以发生（t1/2 = 42.37小时）。对于LDAG，添加MCT也显著降低了t1/2（从20.81小时降至5.20小时）。这表明在油脂产品中，DAG在油相中的分散状态是影响其异构体稳定性的关键因素。迁移最终会达到一个热力学平衡态（sn-1,3 : sn-1,2 ≈ 65:35）。
3. 热性质与结晶动力学结果： * 热行为： 纯sn-1,3 DAG（0% AMD）的结晶和熔化曲线均显示单一峰，对应β晶型的形成。随着AMD增加，结晶曲线出现双峰，熔化曲线出现多峰，分别对应于sn-1,2 DAG形成的α、β‘晶型以及sn-1,3 DAG的β晶型。PDAG的结晶/熔化温度范围比LDAG更窄、温度更高（链长效应）。随着AMD增加，高熔点β/β‘晶型的结晶和熔化温度降低，结晶和熔化过程在更短的温度范围内完成。 * 固体脂肪含量（SFC）： LDAG的SFC曲线在熔化过程中出现一个“平台区”，即在一定温度范围内SFC保持相对恒定，这归因于其α晶型与β/β‘晶型熔化温度差异较大。随着AMD增加，该平台区变窄。PDAG的SFC曲线则更平缓，无显著平台。在37°C（口腔温度）下，达到平衡态（~35% AMD）的LDAG仍保持约70%的SFC，并具有陡峭的熔化曲线，这可能赋予其良好的口熔特性。 * Avrami分析： 纯sn-1,3 LDAG和PDAG的Avrami指数（n）分别约为3和2，表明其晶体生长分别为球形和盘状。迁移发生后，结晶过程分为两个阶段（阶段1：β/β‘晶型；阶段2：α晶型）。阶段1中，两种DAG的n值均降至约2，表明晶体生长机制趋于一致。阶段2中，PDAG的n值仍为~2，而LDAG的n值大于4，表明LDAG的α晶型结晶更为无序。PDAG的结晶速率常数（k）普遍高于LDAG，结晶半时间（t1/2）更短，表明其结晶更快。
4. 晶体多晶型与形态结果： * 多晶型： XRD证实，纯sn-1,3 DAG仅形成β晶型（β1和β2）。随着AMD增加，LDAG中出现了β‘晶型的特征峰，而PDAG中则出现了α晶型的特征峰。在25°C储存24小时后，迁移后的LDAG主要形成β+β‘混合晶型，而迁移后的PDAG主要形成β+α混合晶型。 * 晶体形态： PLM观察显示，纯sn-1,3 DAG（0% AMD）形成细小、排列不规则针状晶体。随着AMD增加，晶体逐渐聚集形成更有序的结构：10% AMD时出现中心散射状聚集；20% AMD时形成小的马耳他十字形聚集体；35% AMD时出现大的马耳他十字形晶体。这种转变归因于sn-1,2 DAG的引入（带来α和β‘晶型）释放更多结晶焓，驱动晶体重组为更稳定、有序的排列方式。
五、 研究结论与价值
本研究成功开发了一种低温、高效的混合溶剂结晶法，用于纯化sn-1,3 DAG，避免了高温引起的酰基迁移。系统阐明了温度与体系分散度对sn-1,3 DAG酰基迁移动力学的显著影响，为控制油脂产品中DAG异构体比例提供了关键参数。更重要的是，研究首次详细揭示了酰基迁移程度如何从根本上改变DAG的结晶行为、热性质、晶体网络结构和形态。具体而言，酰基迁移导致DAG从单一的β晶型转变为β/β‘或β/α混合晶型，结晶和熔化温度范围缩短，晶体从无序针状转变为有序的马耳他十字形聚集体。这些变化直接影响了产品的固体脂肪含量曲线、熔化特性和质构。
科学价值： 深化了对DAG异构体组成与其宏观物理化学性质之间构效关系的理解，特别是酰基迁移作为连接合成/纯化工艺与最终产品性能的关键桥梁作用。为功能脂质结晶学提供了新的实验数据和机理见解。
应用价值： 研究结论可直接指导食品工业中定制化DAG油脂产品的开发。通过精确控制纯化条件、储存温度及在基料油中的分散状态，可以调控DAG的酰基迁移程度，进而“定制”最终产品所需的特定熔点范围、口熔特性、固体脂肪含量曲线和晶体网络硬度，用于开发具有特定质构和健康宣称（高sn-1,3 DAG含量）的功能性脂肪产品。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
研究还指出，纯sn-1,3 DAG的Avrami指数差异（LDAG的n~3，PDAG的n~2）反映了其初始晶体生长形态的不同（球形 vs. 盘状），这为理解不同链长饱和DAG的结晶本性提供了线索。此外，文中提及的通过¹H NMR的β-质子积分比来定量分析DAG异构体比例的方法，是研究酰基迁移动力学的关键可靠技术。补充数据（在线附件）可能提供了更详细的色谱、谱图及原始数据，增强了研究的可重复性和深度。