学术研究报告：关于治疗性蛋白质在运输过程中聚集行为与振动参数关系的研究

一、 研究团队与发表信息 本研究由来自日本大阪大学（Osaka University）工程学研究科生物技术系的Shinji Kizuki、Zekun Wang、Tetsuo Torisu、Susumu Uchiyama，以及日本爱斯佩克株式会社（Espec Corp）的Satoru Yamauchi共同完成。研究论文《Relationship between aggregation of therapeutic proteins and agitation parameters: acceleration and frequency》发表于2023年的《Journal of Pharmaceutical Sciences》（第112卷，第492-505页）。

二、 研究背景与目的 本研究属于生物制药科学与蛋白质制剂稳定性研究领域。治疗性蛋白质，如单克隆抗体和Fc融合蛋白，是重要的生物制剂，但其固有的不稳定性导致在制造、储存和运输过程中易产生聚集体。这些聚集体，尤其是微米级颗粒，可能引发免疫原性风险，是药品安全性的重大关切。在运输过程中，蛋白质溶液会经历复杂的机械应力，包括高频低重力加速度（g力）的振动和低频高g力的冲击。传统上，高g力冲击被认为是运输诱导聚集的主要原因，但近年研究提示，模拟实际运输条件的低g力振动可能是更关键的因素。然而，此前研究尚未系统阐明振动参数（频率和加速度）与蛋白质聚集生成之间的定量关系，且多数研究使用的设备（如轨道摇床）无法独立控制频率和加速度。因此，本研究旨在利用可独立控制三维振动频率和加速度的运输测试系统，探究低g力应力参数与蛋白质聚集生成之间的明确关系，识别关键阈值，并探讨聚集生成的机制，从而为优化蛋白质制剂、包装和运输策略提供科学依据。

三、 详细研究流程 本研究包含多个相互关联的实验流程，系统探究了振动参数对两种模型蛋白（IgG和CTLA4-Ig）聚集行为的影响及其潜在机制。

1. 材料准备与样品处理： 研究选用利妥昔单抗（Rituximab）作为IgG模型，阿巴西普（Abatacept， CTLA4-Ig）作为融合蛋白模型。蛋白质经过透析置换至目标缓冲体系：IgG置于含或不含150 mM NaCl的20 mM组氨酸缓冲液（pH 6.0）中；CTLA4-Ig置于10 mM磷酸盐缓冲液（pH 5.0，接近其等电点以增加不稳定性）。所有蛋白质溶液浓度调整为0.5 mg/mL（除非另有说明），并以1 mL体积灌装入2 mL硼硅酸盐玻璃小瓶或环烯烃聚合物（Cycloolefin Polymer, COP）小瓶中。研究中还使用了表面活性剂泊洛沙姆188（Poloxamer 188, P188）来探究界面介导的聚集。

2. 振动应力测试： 核心实验使用Espec公司制造的TRE-200运输测试系统对样品瓶施加三维振动应力。该系统可独立且精确地控制振动的频率（10-55 Hz）和加速度（垂直方向g值，最高至9.7 g）。样品瓶水平固定，以最大化溶液与橡胶塞及气-液界面的接触，模拟最差降解场景。实验设置了多种频率（10, 20, 30, 40, 50, 55 Hz）与加速度的组合，对每种组合下的三瓶样品进行长达24小时（IgG）或6小时（CTLA4-Ig）的振动处理。同时设置静置对照。

3. 聚集体的分析与表征： 振动处理后，混合同组三瓶样品进行分析，以确保样品量充足并取平均值。 * 尺寸排阻高效液相色谱（Size-Exclusion High-Performance Liquid Chromatography, SE-HPLC）：用于定量溶液中的单体（Monomer）和纳米级聚集体（Nanometer aggregates）。通过分析峰面积计算单体回收率、总可溶性蛋白回收率以及纳米聚集体的相对含量。 * 流式成像显微分析（Flow Imaging Microscopy, FIM）：用于计数粒径≥2 μm的微米级聚集体（Micron aggregates）的数量浓度。设定1332个/mL（IgG in HB NaCl）等作为判断聚集是否显著增加的阈值（初始值均值+3倍标准差）。 * 定量激光衍射（Quantitative Laser Diffraction, QLD）：用于分析0.3-2 μm范围内的亚微米级聚集体（Submicrometer aggregates）的粒径分布和数量。 * 支持向量机（Support Vector Machine, SVM）算法：作为一种新颖的数据分析方法，本研究采用线性SVM对IgG in HB NaCl的实验数据（频率、加速度及对应的微米聚集是否增加的标签）进行训练，以找到一个最优的“超平面”（决策边界），从而量化界定“微米聚集体生成阈值”。随后将此阈值模型应用于其他蛋白配方（IgG in HB, CTLA4-Ig in PB），以检验其普适性。

4. 机制探究实验： * 表面活性剂抑制实验：向CTLA4-Ig溶液中添加不同浓度（0.008%, 0.08%, 0.8%）的P188，然后进行阈值以上（Above the Threshold, AAT）和阈值以下（Below the Threshold, ABT）的振动，分析其对微米和纳米聚集体生成的影响，以区分界面介导与体相介导的聚集路径。 * 界面作用探究实验： * 气-液界面作用：对含0.8% P188的CTLA4-Ig溶液进行ABT振动，一组保留顶空（有气-液界面），另一组充满溶液（无气-液界面），比较纳米聚集体的生成。 * 固-液界面作用：比较CTLA4-Ig在COP瓶和硼硅酸盐玻璃瓶中经ABT振动后纳米聚集体的生成差异。通过预先在瓶中吸附IgG或涂覆硅油（模拟吸附层），然后加入蛋白-free缓冲液，再进行AAT或ABT振动，检测从固-液界面侵蚀（Erosion）下来的微米颗粒或硅油滴，以直接证明AAT应力对界面吸附层的侵蚀作用。 * 高速摄像分析：使用高速摄像机（10,000帧/秒）记录在不同频率和加速度组合下（如50 Hz 6.3 g vs 50 Hz 3.5 g），小瓶内流体（蛋白质溶液）的运动波形，直观对比AAT和ABT条件下液面波动的规律性。 * 参数影响研究：系统改变多个制剂相关参数（如表1所示），包括溶液粘度（通过添加蔗糖调节至0.9， 8.9， 18.9 cP）、蛋白浓度（0.5， 5， 10 mg/mL）、灌装体积（1 mL， 2 mL）、小瓶尺寸（16x33 mm， 18x40 mm）、小瓶方向（水平，垂直）和温度（室温， 5°C），在50 Hz频率下测试3.5 g， 4.1 g， 4.5 g三个加速度点，观察这些参数如何影响微米聚集体生成的阈值。

四、 主要研究结果 1. 微米聚集体生成存在明确的频率-加速度阈值： 对IgG in HB NaCl进行24小时振动测试发现，微米聚集体的数量浓度仅在加速度超过某个特定值时才会显著增加，且该阈值随频率升高而线性升高（图1a）。SE-HPLC结果显示，在所有测试条件下，纳米聚集体的相对含量均未增加（表S2）。亚微米聚集体的生成趋势与微米聚集体一致，仅出现在阈值以上（图S5）。这一现象在另外两种配方（IgG in HB 和 CTLA4-Ig in PB）中也得到了验证（图1b， c；图2a）。使用从IgG in HB NaCl数据训练得到的线性SVM模型，可以成功地将另外两种配方的数据点以较高准确率（79.0%）分类为“聚集增加”和“聚集未增加”两类（图3），表明该阈值具有跨蛋白和配方的普适性。

2. 阈值以上（AAT）聚集主要由界面介导，且表面活性剂可有效抑制： 对于CTLA4-Ig，添加0.08%和0.8%的P188能完全抑制由AAT应力引起的微米聚集体增加（图4a）。这表明AAT诱导的微米聚集主要通过界面（气-液和/或固-液界面）介导的路径发生，而表面活性剂通过竞争性吸附保护了蛋白质。

3. 振动（包括阈值以下ABT）可加速体相中的自发寡聚化： 与IgG不同，不稳定的CTLA4-Ig在静置时就会发生自发寡聚化（纳米聚集体增加）。研究发现，无论是AAT还是ABT振动，都会加速CTLA4-Ig的这种自发寡聚化（图2c， d）。关键的是，即使添加了0.8% P188（远高于其临界胶束浓度），这种加速效应依然存在（图4b， c）。去除气-液界面或改变小瓶材质（COP vs. 玻璃）均不影响ABT振动下纳米聚集体的增加（图4d， e）。这些结果强有力地证明，振动加速纳米聚集体生成是一个体相介导（Bulk-mediated） 的过程，可能与增强分子碰撞频率有关，且表面活性剂无法阻止此过程。

4. AAT应力高效侵蚀固-液界面吸附层，且需气-液界面参与： 侵蚀实验表明，对于预先吸附了蛋白质或涂覆了硅油（模拟吸附层）的小瓶，AAT应力能有效将吸附层物质侵蚀到溶液中形成微米颗粒/液滴，而ABT应力或静置则不能（图5a， b）。更重要的是，当移除小瓶顶空气-液界面（即完全灌满）后，AAT应力也无法侵蚀硅油层（图5b）。这表明，AAT条件下剧烈的、不规则的液面波动（高速摄像证实，图6）产生的毛细管力等作用，是导致固-液界面吸附层被剥离的关键，而这一过程需要气-液界面的动态参与。

5. 影响阈值的因素主要与流体动力学相关： 参数研究表明，蛋白浓度、溶液粘度和温度不影响微米聚集体的生成阈值。然而，增加灌装体积和垂直放置小瓶会降低阈值（即在更低的加速度下即发生聚集），而使用更大尺寸的小瓶会升高阈值（图7）。这些因素共同影响了溶液在瓶中的高径比（H/D比）。高径比越大，液面越容易在振动下发生破裂和不稳定，这与高速摄像观察到的现象一致（图S8），进一步支持了阈值由流体动力学行为主导的结论。

五、 研究结论与价值 本研究首次系统揭示了低g力振动诱导治疗性蛋白质产生聚集体的关键规律：存在一个由频率和加速度共同决定的微米聚集体生成阈值。该阈值主要由流体动力学（液面波动的稳定性）决定，而非蛋白质本身的特性，因此具有较广的普适性。阈值以上（AAT）的振动主要通过界面介导的路径（涉及气-液和固-液界面的动态作用及吸附层侵蚀）产生微米聚集体，可被表面活性剂有效抑制；而所有振动（包括阈值以下的ABT）都可能加速蛋白质在体相中自发的寡聚化（纳米聚集体），这是一个表面活性剂无法阻止的体相过程。

科学价值：该研究深化了对机械应力诱导蛋白质聚集机制的理解，明确了低g力振动中频率和加速度的协同效应，并区分了界面介导与体相介导两种不同的聚集路径，为建立更精确的蛋白质聚集理论模型提供了关键数据。

应用价值： 1. 指导稳定性评估策略：研究指出，在实验室模拟运输条件的随机振动测试中，若采用通过提高加速度来压缩测试时间的“时间压缩”方案，必须谨慎。如果实际运输振动水平低于阈值，而加速测试超过了阈值，则可能严重高估聚集风险，导致误判。这为制定更合理的药物运输稳定性测试方案提供了重要依据。 2. 指导制剂与包装开发：除了添加表面活性剂，还可以通过优化包装和运输流程（如使用气垫悬挂卡车）将振动水平控制在阈值以下，从而降低微米聚集体生成风险。同时，优化初级包装材料（如采用蛋白质吸附更少的COP材料）也能减少固-液界面介导的聚集。这为开发低表面活性剂甚至无表面活性剂的稳定蛋白制剂提供了新思路。 3. 指导处方开发：对于易于发生体相寡聚化的不稳定蛋白，需通过优化蛋白质序列和处方（如调整pH、离子强度、添加稳定剂）来提高其本征稳定性，因为表面活性剂对振动加速的体相聚集无效。

六、 研究亮点 1. 发现普适性阈值：首次明确提出了低g力振动诱导蛋白质微米聚集的“频率-加速度”阈值概念，并通过SVM建模量化，证明该阈值在不同蛋白和配方间具有共性。 2. 机制深度解析：通过精巧的实验设计（如侵蚀实验、界面去除实验、不同材质小瓶对比），清晰地区分并证明了AAT应力下界面介导的微米聚集与ABT/AAT应力下体相介导的纳米聚集这两种并行但机制不同的聚集路径。 3. 方法学创新：创新性地将运输测试系统（可控三轴振动）与高速摄像流体分析、机器学习分类算法（SVM） 相结合，建立了连接宏观振动参数、微观流体行为与蛋白质聚集之间的桥梁。 4. 明确的实践指导意义：研究结论直接挑战了常见的“时间压缩”加速测试方法的适用性，并对制剂和包装开发提供了具体、可操作的 mitigation strategies（缓解策略），具有很高的工业转化价值。

七、 其他有价值内容 研究还通过高速摄像直观展示了阈值上下流体行为的根本差异：AAT条件下液面产生不规则、破裂的突起波，而ABT条件下液面波动则相对规则平稳。这为阈值存在的流体动力学本质提供了最直接的视觉证据。此外，研究将历史文献中使用水平/轨道摇床进行强制降解研究的数据点绘制在本研究的阈值图上，发现其聚集与否的趋势与该阈值线大致吻合，进一步支持了本研究发现阈值的广泛相关性。