本研究由来自美国国立卫生研究院神经疾病与卒中研究所（NINDS）突触功能研究组的Zu-hang Sheng博士（通讯作者）及其团队成员Bing Zhou、Panpan Yu、Mei-yao Lin、Tao Sun、Yanmin Chen，以及中国暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院的Panpan Yu（共同作者）共同完成。研究成果以题为《通过增强线粒体运输和挽救能量亏缺促进轴突再生》（Facilitation of axon regeneration by enhancing mitochondrial transport and rescuing energy deficits）的论文形式，于2016年发表在《Journal of Cell Biology》（JCB）期刊第214卷第1期（页码103-119）。这项研究揭示了神经元成熟过程中轴突线粒体运输能力下降及其导致的损伤后能量供应不足，是限制成年中枢神经系统（CNS）轴突再生能力的关键内在机制。
本研究的核心学术背景聚焦于神经再生领域的一个基本难题：为何发育中的年轻神经元拥有强大的轴突生长能力，而成熟的中枢神经系统神经元在损伤后通常无法有效再生？既往研究多关注于细胞外抑制因子、信号通路或遗传程序的变化。然而，轴突再生是一个高度耗能的过程，需要大量ATP来支持生长锥重建、细胞骨架重组、物质运输等。线粒体作为细胞的“动力工厂”，其沿轴突微管的双向运输对于远端轴突的能量稳态至关重要。研究团队的前期工作发现，Syntaphilin（SNPH）蛋白是轴突线粒体特有的“静态锚定”蛋白，能特异地将其锚定在微管上。更重要的是，SNPH的表达具有严格的发育调控性：在胚胎期几乎检测不到，出生后逐渐增加，在成年期达到高峰。这一独特的表达模式促使研究者提出了一个引人入胜的假说：成熟神经元中线粒体运输能力的下降（由SNPH表达升高介导），可能是限制其轴突再生能力的一个关键内在机制。因此，本研究的核心目标是探究以下两个根本性问题：（1）成熟神经元是否维持着向受损轴突有效招募线粒体的能力？（2）如果此功能在成熟神经元中衰退，那么增强线粒体运输是否能使其重获再生能力？
详细的研究工作流程系统地验证了这一假说，可分为以下几个关键环节：
第一环节：建立研究模型与初步验证。 研究首先利用了SNPH基因敲除（Knockout, KO）小鼠模型。通过将SNPH KO小鼠与Thy1-mito-CFP转基因小鼠（部分神经元线粒体被CFP标记）杂交，对成年小鼠坐骨神经进行离体成像，直接证实了SNPH缺失能显著增强体内轴突线粒体的运动性（SNPH KO组运动线粒体占比约71.6%，野生型对照组仅约31.0%）。这确立了SNPH KO小鼠是研究增强线粒体运输对轴突再生影响的理想遗传模型。为在体外精确研究轴突再生，研究采用了微流控腔室培养系统。该系统能将神经元胞体与树突限制在“胞体腔”，而轴突则通过长达450微米的微沟道生长到独立的“轴突终末腔”，实现了轴突与胞体的物理和流体隔离。这便于对轴突进行精确损伤（轴突切断术，axotomy）和后续观察。
第二环节：探究SNPH缺失对轴突再生的影响。 研究使用微流控腔室培养来自胚胎第18-19天（E18-19）小鼠的皮层神经元。在培养第4天（DIV4）进行轴突切除后，发现SNPH KO神经元在损伤后3天显示出比野生型（WT）神经元更强的轴突再生长能力。再生长在损伤后7小时即开始，28小时后进入快速增长期。此外，损伤后14小时，SNPH KO神经元轴突末端形成新生长锥的比例也显著高于WT神经元（约69.1% vs 44.5%）。这些结果初步表明，通过敲除SNPH增强线粒体运输，可以促进损伤后轴突再生。
第三环节：揭示成熟神经元再生能力衰退与SNPH表达及线粒体运输下降的相关性。 研究者比较了不同成熟度神经元的再生能力。将神经元在DIV4或DIV12进行轴突切断，结果发现，虽然年轻神经元（DIV7）仍具有一定再生能力，但高度成熟的神经元（DIV18）几乎丧失了再生能力。与此衰退同步发生的是，随着神经元在体外培养时间延长（从DIV7到DIV18），SNPH蛋白表达水平进行性升高，而轴突内线粒体的运动性则进行性下降（从DIV7的约47.6%降至DIV18的约22.9%）。作为对照，晚期内体（Rab7-YFP标记）的运输在同一时期并未下降。这强有力地表明，SNPH表达上调导致的线粒体运输下降，是成熟神经元再生能力衰退的内在机制之一。
第四环节：验证在成熟神经元中增强线粒体运输可重获再生能力。 为了直接证明因果关系，研究者在高度成熟的皮层神经元（DIV12）中，通过慢病毒感染过表达不同基因来操控线粒体运动性。过表达SNPH完全消除了线粒体运动并严重抑制了损伤后再生；过表达其功能缺失突变体SNPH-ΔMTB（缺失微管结合域）影响不大；而过表达线粒体马达适配蛋白Miro1则显著增强了线粒体双向运输，并成功挽救了成熟神经元的轴突再生能力。补充外源性ATP可以部分恢复SNPH过表达神经元的再生能力，而用线粒体ATP合成酶抑制剂寡霉素（oligomycin）处理则会消除SNPH KO神经元增强的再生能力。这证明再生的恢复依赖于线粒体来源的ATP供应。此外，研究还从成年（出生后60天，P60）小鼠背根神经节（DRG）分离成熟神经元，发现SNPH KO的DRG神经元在体外也显示出更强的轴突分支生长能力。这些实验从正反两个方面证实，增强线粒体运输可以通过改善能量供应来促进成熟神经元的轴突再生。
第五环节：探究线粒体运输如何影响能量供应与线粒体完整性。 研究深入到了细胞能量代谢和线粒体健康层面。首先，他们发现过表达SNPH会阻碍线粒体向轴突末梢的输送，减少生长锥内线粒体密度并缩小生长锥尺寸；而过表达Miro1则产生相反效果。利用荧光ATP传感器PercevalHR，他们进一步证明，过表达SNPH会导致轴突最远端区域的ATP/ADP比值下降，即出现局部能量亏缺。接下来，研究的关键发现是：轴突损伤本身是一个急性应激信号。无论是激光还是物理方式切断轴突，都会导致损伤部位附近的线粒体迅速去极化（膜电位丧失），这一现象通过四甲基罗丹明乙酯（TMRE，膜电位依赖性染料）和MitoTracker Green FM（膜电位非依赖性染料）的共标记实验得到证实。同时，使用另一种FRET-based ATP传感器GO-ATeam2进行实时成像，发现轴突切断会立即引起损伤部位毫摩尔水平的ATP耗竭。
第六环节：阐明增强运输如何挽救能量亏缺。 研究者提出了核心机制假设：增强线粒体运输有助于清除损伤部位的受损线粒体，并补充健康的线粒体，从而挽救能量亏缺。他们通过一系列实验验证了这一假设：（1）在微沟道内测量线粒体“通量”（单位时间通过的数量），发现SNPH KO神经元在轴突切断前后的线粒体双向运输事件均显著多于WT神经元。（2）轴突切断后，WT神经元损伤近端线粒体的TMRE信号恢复缓慢，而SNPH KO神经元中恢复得更快，表明其线粒体完整性恢复能力更强。（3）利用PercevalHR和GO-ATeam2两种传感器均检测到，轴突切断后6小时内，SNPH KO神经元再生轴突尖端的ATP/ADP比值或ATP水平显著高于WT神经元。过表达Miro1也能在WT神经元中产生类似的挽救能量亏缺的效果。这些数据共同表明，增强的线粒体运输通过快速更新损伤部位的线粒体库，恢复了局部ATP生产，为再生提供了能量基础。
第七环节：体内实验验证。 为了将体外发现推向生理相关环境，研究团队进行了小鼠坐骨神经挤压伤模型实验。对成年SNPH KO和WT小鼠进行坐骨神经挤压，3天后分析神经纵切切片。通过检测再生轴突标记物GAP-43，他们发现SNPH KO小鼠的再生轴突在损伤点远端延伸得更远、数量更多，再生指数显著高于WT小鼠。这表明增强线粒体运输确实能加速体内周围神经系统的轴突再生。此外，他们还发现坐骨神经损伤后，SNPH KO小鼠的背根神经节神经元中GAP-43的表达上调更为显著，提示增强的能量供应可能激活了与再生相关的内在基因程序。
本研究的主要结果层层递进，逻辑严密：从证实SNPH缺失增强线粒体运输并促进体外再生开始，到揭示这种促进效应与发育阶段及SNPH表达水平相关，再到通过基因操控直接证明增强运输可挽救成熟神经元再生能力并揭示其ATP依赖性，最后深入到损伤应激导致线粒体去极化和ATP耗竭、而增强运输能清除受损线粒体并补充健康线粒体从而恢复能量供应的细胞机制，最终通过体内实验证实其生理意义。每一步的结果都为下一步的研究提供了依据和方向。
结论： 本研究首次系统地揭示了轴突线粒体运输能力随神经元成熟而下降是限制其再生能力的一个关键内在细胞学通路。损伤急性期导致的局部线粒体功能障碍和ATP耗竭，在运输能力低下的成熟神经元中无法被有效纠正，从而造成再生失败。而通过遗传手段（如敲除SNPH或过表达Miro1）增强线粒体运输，能够促进健康线粒体向损伤部位补充并移除受损线粒体，从而挽救能量亏缺，最终促进轴突再生。这为理解成熟CNS神经元再生能力的内在限制提供了全新的视角。
研究的价值与意义： 本研究的科学价值在于，它将细胞能量代谢与轴突再生这一经典难题直接联系起来，提出了“能量亏缺”是再生失败的一个重要限制因素。它发现并验证了SNPH这一发育调控的线粒体锚定蛋白是控制成熟神经元线粒体运输和再生能力的关键分子开关。在应用价值上，该研究指出，促进线粒体向损伤轴突的运输和改善局部能量供应，可以成为一个有潜力的治疗新靶点，为开发刺激神经损伤后轴突再生和功能恢复的新策略提供了理论依据和实验基础。
研究亮点： 1. 创新性的假说与机制发现：首次将线粒体运输的发育性下降、损伤引起的局部能量危机与轴突再生失败三者联系起来，阐明了一个全新的内在限制再生能力的细胞通路。 2. 多层次、严谨的实验验证体系：从体外微流控精确操控与成像，到离体神经组织观察，再到体内动物模型验证，构建了完整证据链。正反两方面的遗传学操控（敲除与过表达）有力证明了因果性。 3. 先进的细胞能量与线粒体功能实时成像技术：熟练运用多种基因编码的荧光传感器（PercevalHR, GO-ATeam2）和膜电位染料（TMRE），在活细胞、单轴突水平实时监测ATP水平、ATP/ADP比值和线粒体膜电位变化，动态揭示了损伤与修复过程中的能量代谢事件。 4. 理想的遗传学模型：SNPH KO小鼠因其线粒体运输增强且无其他明显发育表型，成为研究此问题的完美模型。SNPH独特的发育表达模式使其发现更具说服力。 5. 明确的转化医学启示：研究不仅解释了生物学现象，更直接指出了通过干预线粒体运输来促进神经再生的潜在治疗方向。
这项研究是一项整合了细胞生物学、神经科学和能量代谢的典范工作，深化了对轴突再生失败机制的理解，并为未来的神经修复治疗策略开辟了新的思路。