留尼汪岛特有药用植物 Phyllanthus phillyreifolius 富含geraniin的提取物在斑马鱼非毒性剂量下抑制寨卡病毒和登革病毒感染
主要作者与研究机构： 本研究由Chaker El Kalamouni领导，主要完成人包括Juliano G. Haddad、Dovilė Grauzdytė、Andrea Cristine Koishi、Wildriss Viranaicken、Petras Rimantas Venskutonis、Claudia Nunes Duarte dos Santos、Philippe Desprès和Nicolas Diotel。研究团队来自法国留尼汪大学（Université de la Réunion）热带岛屿感染过程混合研究单位（UMR PIMIT）、立陶宛考纳斯科技大学（Kaunas University of Technology）食品科学与技术系、巴西卡洛斯·查加斯研究所（Instituto Carlos Chagas）分子病毒学实验室以及法国留尼汪大学DéTROI实验室。该研究于2020年5月15日发表在《Molecules》期刊（2020, 25, 2316）。
研究背景与目的： 寨卡病毒（ZIKV）和登革病毒（DENV）均属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus），是热带及亚热带地区重要的蚊媒病原体。DENV的四种血清型（DENV-1至DENV-4）可引发从登革热到致命性出血性休克等严重疾病，目前尚无有效抗病毒治疗手段。ZIKV自2015年在美洲暴发以来，与先天性寨卡综合征（congenital Zika syndrome, CZS）和格林-巴利综合征（Guillain–Barré syndrome）等严重神经系统并发症密切相关，且可通过性接触、输血及宫内传播等非传统途径感染。面对这两种病毒缺乏有效抗病毒药物的紧迫形势，药用植物因其丰富的生物活性代谢产物而被视为有前景的抗病毒药物来源。留尼汪岛特有药用植物 *Phyllanthus phillyreifolius*（叶下珠属）在当地传统医学中用于治疗腹泻、发热、性病及肾结石疼痛。此前研究证实该植物富含多酚类物质，尤其是geraniin（老鹳草素），并具有强抗氧化活性。geraniin已被报道具有抗菌、抗氧化、抗癌、镇痛、抗病毒及免疫调节等多种药理活性，且对DENV-2具有抑制作用。本研究旨在系统评估 P. phillyreifolius 提取物及其主要活性成分geraniin对ZIKV和DENV的体外抗病毒效果，并利用斑马鱼模型评价其体内急性毒性。
研究方法与流程： 研究共包含五个主要实验环节。第一环节为 P. phillyreifolius 乙醇提取物的制备与植物化学表征。叶片采集自留尼汪岛西南部，干燥粉碎后用70%乙醇水溶液室温搅拌提取两次，合并滤液后经旋转蒸发和冷冻干燥获得干提取物，得率为33.63%。随后采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用（UPLC-QTOF-MS）对提取物进行成分分析，鉴定出六种酚类成分，其中geraniin为最主要的定量成分。通过超高效液相色谱-串联四极杆质谱（UPLC-TQS）以单离子监测模式定量测定geraniin含量，结果为327 mg/g干提取物，折合每克干植物材料含110 mg geraniin。
第二环节为细胞毒性及抗ZIKV和DENV活性的体外评价。首先以MTT法检测 P. phillyreifolius 提取物对人肺上皮A549细胞的细胞毒性，计算半数细胞毒性浓度（CC50）为715 µg/ml，选择250 µg/ml作为最大非细胞毒性浓度（MNTC）用于后续实验。抗ZIKV活性评价采用两种病毒株：表达GFP报告基因的非洲株ZIKV重组分子克隆（ZIKVGFP）和2015年法属波利尼西亚流行的亚洲株ZIKV-PF13。通过流式细胞术检测GFP荧光以监测ZIKVGFP感染，结果显示提取物以剂量依赖方式抑制ZIKV感染，半数抑制浓度（IC50）为55 µg/ml，250 µg/ml时完全抑制感染。对ZIKV-PF13感染的A549细胞，通过RT-qPCR检测细胞内病毒基因组RNA水平，发现提取物处理后病毒RNA量降低达3.5个对数级；空斑形成实验（plaque-forming assay）证实子代病毒产量降低达3个对数级；免疫荧光实验显示病毒E蛋白表达严重受损。对DENV的抗病毒评价采用人肝癌Huh7.5细胞，以DENV-1至DENV-3临床分离株和DENV-4实验室适应株为研究对象，通过病灶形成免疫检测法（foci-forming immunodetection assay）定量感染性子代病毒，结果显示250 µg/ml的提取物使四种血清型的DENV感染力均降低达3个对数级。
第三环节为geraniin的抗病毒活性验证。MTT实验确定geraniin对A549细胞的CC50为420 µg/ml，选择200 µg/ml为最大非细胞毒性浓度。流式细胞术结果显示geraniin在100 µg/ml时对ZIKVGFP感染的抑制率达90%，IC50为22 µg/ml。对ZIKV-PF13，geraniin在200 µg/ml时使病毒RNA拷贝数减少3个对数级，子代病毒产量降低至少3.5个对数级，免疫荧光证实E蛋白表达被严重抑制。DENV作为黄病毒阳性对照，geraniin在200 µg/ml时同样使四种血清型的子代病毒产量降低达3个对数级。根据CC50和IC50计算的选择性指数（selectivity index, SI）分别为：P. phillyreifolius 提取物SI为13，geraniin SI为19。
第四环节为抗病毒作用机制研究。采用加药时间实验（time-of-drug addition assay）解析提取物和geraniin作用的病毒感染阶段。当药物在整个感染过程中持续存在或仅在病毒接种同时加入（吸附/进入阶段）时，病毒复制被抑制至5%以下；但在吸附后2小时加入则无明显抑制效果，提示药物靶向病毒感染周期的早期阶段。病毒灭活实验显示，将ZIKVGFP游离病毒颗粒与提取物或geraniin在37°C孵育2小时后稀释50倍再感染细胞，GFP阳性细胞减少99%，表明药物与游离病毒颗粒发生不可逆的相互作用导致感染力丧失。RNase保护实验排除了病毒颗粒解体释放基因组RNA的可能性。病毒结合实验在4°C条件下进行，使病毒可结合细胞但无法进入。结果显示提取物或geraniin处理组结合到细胞表面的病毒颗粒数量与未处理组相当，而阳性对照表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）则显著减少病毒结合，说明药物不干扰病毒的吸附步骤。病毒内化实验（internalization assay）中，将ZIKVGFP在4°C结合细胞后转移至37°C以触发内化过程，在不同时间点加入药物。结果显示在温度转移后15分钟内加入geraniin可完全抑制病毒进入，GFP阳性细胞减少90%；2小时后加入则无效。提取物与geraniin的内化抑制动力学曲线几乎一致，且与已知内化抑制剂异槲皮苷（isoquercitrin, Q3G）相似，强烈提示geraniin是提取物中主要的活性抗病毒成分，其作用机制是阻断ZIKV颗粒的内化步骤而非吸附步骤。
第五环节为斑马鱼体内毒性评价。以成年斑马鱼为模型，通过腹腔注射给予 P. phillyreifolius 提取物（375 µg/g体重）或geraniin（300 µg/g体重），设置PBS注射对照组。在注射后5天内每日多次观察鱼的行为、摄食和应激表现。结果显示所有处理组和对照组均无死亡（存活率100%），摄食行为和运动行为均正常，无应激迹象。进一步利用ZebraCube系统对geraniin注射鱼的精细运动行为进行定量监测：在适应新水槽10分钟后，记录10分钟的运动活性，将运动状态按速度分为静止（<4 mm/s）、小幅度活动（4–8 mm/s）和大幅度活动（>8 mm/s）。结果显示geraniin注射鱼在注射后1天和5天，三种运动状态下的运动距离与PBS对照组均无显著差异，代表性运动轨迹图也显示两组鱼的活动路径相似。这些数据表明在有效抗病毒浓度下，P. phillyreifolius 提取物和geraniin均未引起斑马鱼的急性毒性或行为异常。
主要结果与结论： 本研究通过RT-qPCR、免疫荧光、空斑形成实验和病灶形成免疫检测等多种病毒学方法，系统证明了留尼汪岛特有植物 P. phillyreifolius 的乙醇提取物在非细胞毒性浓度下能够有效抑制非洲株和亚洲流行株ZIKV以及四种血清型DENV的感染，子代病毒产量降低可达3至3.5个对数级。其主要的活性成分为geraniin，该化合物同样在非细胞毒性浓度下表现出对ZIKV和DENV的强效抑制活性。机制研究表明，P. phillyreifolius 提取物和geraniin并不阻止病毒颗粒吸附至宿主细胞表面，也不破坏病毒颗粒的完整性，而是通过不可逆地中和病毒颗粒的感染力、阻断病毒的内化步骤来阻止感染起始。斑马鱼体内实验证实在有效抗病毒剂量下，提取物和geraniin均未引起急性毒性、死亡率或行为异常，提示该剂量水平对进一步临床前研究是安全的。
研究意义与价值： 从科学价值而言，本研究首次系统报道了 P. phillyreifolius 对ZIKV和DENV的广谱抗病毒活性，并阐明其作用靶点为病毒进入宿主细胞的内化阶段，这为理解geraniin类鞣花单宁化合物的抗病毒分子机制提供了新的实验证据。值得指出的是，本研究发现的geraniin抑制ZIKV内化的机制不同于此前报道的来源于红毛丹（*Nephelium lappaceum*）果皮的geraniin通过抑制DENV-2与宿主细胞结合发挥作用，提示geraniin对不同黄病毒可能存在差异化的作用方式。从应用价值而言，本研究将 P. phillyreifolius 纳入具有抗医学重要黄病毒活性的叶下珠属植物群体，为从留尼汪岛乃至马斯克林群岛特有植物资源中开发天然、安全的抗病毒药物提供了重要的候选先导化合物和实验依据。研究建立了一套从植物化学表征、体外抗病毒评价、机制解析到斑马鱼体内毒性评价的完整研究流程，为后续药用植物抗病毒研究提供了可借鉴的技术路线。
研究亮点： 第一，研究对象具有地域特殊性——P. phillyreifolius 是留尼汪岛特有的药用植物，体现了海岛生物多样性在药物发现中的价值。第二，研究系统性地将植物提取物与其主要单体化合物geraniin进行平行评价，通过比较两者的内化抑制动力学曲线，有力证明了geraniin是提取物中主要的抗病毒活性成分。第三，机制研究设计精细，通过时间加药实验、病毒灭活实验、RNase保护实验、结合实验和内化实验的组合运用，精确定位了药物的作用窗口在病毒吸附之后、内化完成之前的早期进入阶段。第四，采用ZebraCube系统对斑马鱼精细运动行为进行定量分析，将“无急性毒性”的判断从传统的存活率和粗略行为观察提升到精细运动行为学的定量水平，为植物提取物的安全性评价提供了更为敏感的检测维度。