本研究由Yaoqi Wu、Wenkai Lv、Shaofeng Xiong等学者共同完成，通讯作者为南昌大学第一附属医院药学部、南昌大学江西医学院的Yanni Lv。研究团队来自南昌大学第一附属医院、江西省中医药研究院、湖北中医药大学、江西中医药大学等多家机构。该原创研究论文发表于Phytomedicine第149卷（2025年），文章编号157508，于2025年11月4日在线发表，DOI为10.1016/j.phymed.2025.157508。

该研究属于神经药理学与中药药理学交叉领域，聚焦于脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury）的治疗机制探索。脑缺血再灌注损伤是全球范围内导致残疾的主要因素之一，其病理过程涉及免疫细胞激活、炎症级联反应以及中性粒细胞（neutrophil）在缺血部位的聚集。中性粒细胞通过释放中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps, NETs）等机制加剧神经炎症损伤，因此促进中性粒细胞的清除成为缺血性脑卒中治疗的重要策略。小胶质细胞（microglia）是中枢神经系统的常驻免疫细胞，其吞噬功能在清除中性粒细胞、恢复脑组织稳态中发挥关键作用，但吞噬过程需要大量能量供应。已有研究表明，小胶质细胞的能量代谢状态与其吞噬功能密切相关，氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）是吞噬过程的主要能量来源。降香黄檀（Dalbergia odorifera T.C. Chen）的心材“降香”具有多种生物活性，而其叶片已被列入海南省地方食品安全标准（标准号：DBS46/003‒2021）。研究团队前期工作已证实降香黄檀叶提取物（Dalbergia odorifera leaf extract, DLE）能够减轻脑缺血再灌注后的脑水肿并保护血脑屏障，但其对小胶质细胞吞噬功能的影响及深层机制尚不明确。本研究旨在利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、体内外实验及能量代谢检测等技术，系统阐明DLE通过调控小胶质细胞能量代谢促进中性粒细胞吞噬的分子机制。

研究流程可分为以下几个主要环节。第一，DLE的制备与成分分析。叶片采自海南省三亚市尖峰岭地区，以70%乙醇加热回流提取两次，经旋转蒸发和冻干后得到DLE。采用Folin–Ciocalteu法测定其多酚含量为每克干重相当于12.19毫克没食子酸。第二，动物模型建立与分组给药。选用8至10周龄、体重18至22克的雄性C57BL/6小鼠，建立大脑中动脉闭塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R）模型，缺血1小时后再灌注24小时。DLE在造模前连续灌胃给药一周，剂量参考前期大鼠实验换算；阳性对照组腹腔注射依达拉奉（edaravone, EDA）3 mg/kg。第三，脑损伤表型评估。通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色测定脑梗死体积，采用伊文思蓝（Evans blue, EB）染料评估血脑屏障通透性，进行神经功能缺损评分，利用激光多普勒血流仪检测脑血流，并通过苏木精-伊红（H&E）染色和尼氏（Nissl）染色观察神经元损伤和炎症浸润。第四，转录组测序分析。对假手术组、MCAO/R组和MCAO/R+DLE2.4组的脑组织进行bulk RNA测序，筛选差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），并进行GO和KEGG通路富集分析。第五，单细胞RNA测序与细胞亚群分析。利用10× Genomics Chromium平台对脑组织单细胞悬液进行建库和测序，经Seurat流程质控、降维和聚类后，共获得94,246个高质量细胞，鉴定出12种细胞类型，包括星形胶质细胞、内皮细胞、小胶质细胞、神经元、中性粒细胞等。进一步将31,188个小胶质细胞聚类为7个亚群，将541个中性粒细胞聚类为5个亚群。利用AddModuleScore函数计算各细胞亚群的吞噬评分、OXPHOS评分、M1/M2极化评分，并采用Pearson相关分析探讨各功能模块间的关联。通过Monocle2和CytoTRACE进行细胞分化轨迹推断，利用SCENIC筛选分化相关的转录因子。第六，体内外吞噬功能验证。在体内实验中，通过免疫荧光染色检测Tmem119+小胶质细胞与Ly6G+中性粒细胞的共定位，以及CD68+吞噬溶酶体的表达；通过Western blot检测Ly6G、MPO、NE和H3Cit等中性粒细胞及NETs相关蛋白的表达水平。在体外实验中，建立氧糖剥夺/再复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R）模型，将小胶质细胞与中性粒细胞以3:1比例共培养，用250 nM DLE干预，通过免疫荧光和Western blot评估小胶质细胞对中性粒细胞的吞噬作用。第七，能量代谢检测。利用2-NBDG摄取实验评估葡萄糖摄取能力，检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）活性和细胞内乳酸水平，测定线粒体呼吸链复合物I、III、IV（mitochondrial respiratory chain complexes I/III/IV, MRCC I/III/IV）活性，使用氧消耗检测试剂盒评估耗氧量，以及测定细胞内ATP含量。第八，信号通路验证。通过CellChat或CellTalker分析细胞间通讯，重点考察Gas6-Axl、Gas6-MerTK、Gas6-Tyro3受体-配体对的相互作用，并结合Western blot和免疫荧光染色验证Gas6信号通路相关蛋白的表达变化。

研究结果显示，在脑缺血再灌注损伤小鼠中，DLE显著减小脑梗死体积，改善脑血流，降低神经功能缺损评分，并减轻神经元损伤和炎症浸润，高剂量DLE的效果与依达拉奉阳性对照组相当。bulk RNA-seq分析显示，MCAO/R后129个基因下调、154个基因上调，而DLE处理后64个基因下调、34个基因上调，DEGs显著富集于免疫反应激活、细胞趋化、细胞因子介导的信号通路、白细胞迁移等生物过程。scRNA-seq分析发现，MCAO/R后细胞间通讯的数量和强度均显著增加，DLE处理则进一步调节了细胞间互作模式。小胶质细胞亚群分析鉴定出7个亚群，其中microglia_C4同时具有较高的M1和M2评分，提示小胶质细胞极化状态存在动态过渡。DLE处理改变了小胶质细胞亚群的分布比例，microglia_C1、C2、C4和C6在DLE组中富集。分化轨迹分析显示小胶质细胞沿着从microglia_C3/C5到C7/C4/C6再到C1/C2的路径分化，多个转录因子如Ets1、Lef1、Erg、Runx1等随分化进程表达升高，而Fos、Stat3、Klf2、Irf5等表达降低。能量代谢分析表明，MCAO/R组糖酵解通路显著上调，而DLE处理组氧化磷酸化、磷酸肌醇代谢和戊糖磷酸通路表达增强。Pearson相关分析显示氧化磷酸化评分与M2评分呈显著正相关（r=0.20），与M1评分呈负相关（r=-0.24）；M1评分（r=0.34）和M2评分（r=0.38）均与吞噬评分正相关；氧化磷酸化评分与吞噬评分呈显著正相关（r=0.30）。在体内，DLE处理显著减少缺血脑区Ly6G+中性粒细胞的数量，降低MPO、NE和H3Cit蛋白表达，抑制NETs形成。免疫荧光和三维重建显示，DLE处理后Tmem119+小胶质细胞与Ly6G+中性粒细胞共定位减少，CD68+吞噬溶酶体表达上调，且与Tmem119共定位增强。体外OGD/R模型实验验证了DLE促进小胶质细胞吞噬中性粒细胞的作用，Western blot显示Ly6G、MPO、NE和H3Cit表达均显著下降。能量代谢实验表明，DLE降低小胶质细胞对2-NBDG的摄取、降低LDH活性和乳酸水平，同时提高MRCC I、III、IV活性，增加氧消耗和ATP生成。Gas6信号通路分析显示，DLE处理上调Gas6、Axl、MerTK和Tyro3的蛋白表达水平，免疫荧光证实Tmem119与Gas6、Axl、MerTK、Tyro3共定位，说明DLE通过激活Gas6-TAM受体信号通路重编程小胶质细胞能量代谢，增强吞噬功能。

研究结论表明，降香黄檀叶提取物能够显著减轻脑缺血再灌注损伤，其机制在于通过调节小胶质细胞的分化状态，促进其吞噬清除中性粒细胞，减少中性粒细胞在脑内的聚集和NETs形成。DLE通过Gas6-Axl/MerTK/Tyro3信号通路重编程小胶质细胞的能量代谢，将代谢模式从糖酵解转向氧化磷酸化，提高ATP生成，为吞噬过程提供充足能量。该研究首次在单细胞水平系统揭示了DLE调控小胶质细胞能量代谢与吞噬功能的分子机制，为缺血性脑卒中的治疗提供了新的策略和靶点。其科学价值在于深化了对小胶质细胞代谢重编程与免疫功能调控之间关系的理解，阐明了Gas6-TAM信号通路在脑缺血再灌注损伤中的新功能。其应用价值在于降香黄檀叶作为地方食品安全标准收录的原料，兼具安全性和药用潜力，DLE有望开发为脑缺血再灌注损伤的辅助治疗药物或功能食品成分。

本研究的亮点包括：第一，首次将降香黄檀叶提取物的神经保护机制聚焦于小胶质细胞吞噬功能与能量代谢重编程的关联；第二，运用scRNA-seq技术精细解析了脑缺血再灌注后小胶质细胞和中性粒细胞的异质性及分化轨迹，发现小胶质细胞存在超越经典M1/M2二分法的复杂极化状态；第三，整合bulk RNA-seq、单细胞转录组、体内外吞噬功能实验和代谢检测，形成从分子到功能的完整证据链；第四，明确了Gas6-Axl/MerTK/Tyro3信号通路在DLE促进小胶质细胞吞噬中的依赖性作用。此外，研究也指出了一些局限性，如CD68表达可能涉及小胶质细胞以外的其他吞噬细胞、Pearson相关系数未超过0.5提示相关性强度有限、尚需代谢组学数据以及基因沉默实验进一步验证Gas6通路的功能。数据可用性方面，scRNA-seq数据已上传至NCBI GEO（GSE280459），bulk RNA-seq数据保存于NCBI SRA（RJNA1169939）。