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氧化石墨烯通过内质网应激破坏3D人脑类器官脂质稳态的机制研究

第一作者及机构
本研究由Xudong Liu（茅台学院食品科学与工程系）、Chao Yang（浙江海洋大学国家海洋养殖工程技术研究中心）等共同完成，通讯作者为Lei Zhang（加拿大滑铁卢大学化学工程与纳米技术研究所）和Yi Cao（南华大学公共卫生学院）。研究成果发表于《Science of the Total Environment》期刊2022年第849卷。

研究背景与目标
氧化石墨烯（Graphene Oxide, GO）因其在环境治理、电子器件和生物医学等领域的广泛应用，其潜在的神经毒性备受关注。已有研究表明，GO可穿过血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）进入中枢神经系统（Central Nervous System, CNS），并在动物模型中干扰脂质稳态。然而，传统2D细胞模型和动物模型无法完全模拟人脑的复杂性。因此，本研究利用3D人脑类器官（3D human brain organoids）模型，结合转录组学（transcriptomics）和脂质组学（lipidomics），探究GO通过内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）应激影响脂质代谢的分子机制。

研究流程与方法
1. GO表征
- 通过原子力显微镜（AFM）、透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）分析GO的形貌、厚度（约5 nm）、水动力尺寸（585.13 nm）和表面电位（-44.36 mV）。X射线衍射（XRD）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）验证了GO的化学结构。

1. 3D人脑类器官培养与暴露实验

   • 使用人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为神经前体细胞（NPCs），经90天培养形成直径约1.5 mm的类器官，表达皮质层标志物（如TBR1、Brn2）。
     
   • 类器官暴露于0、12.5或50 μg/mL GO 24小时，通过吖啶橙/ DAPI染色评估细胞毒性，发现50 μg/mL GO使细胞存活率降至83.4%。

2. 转录组学分析

   • RNA测序（RNA-seq）显示，50 μg/mL GO显著上调80个基因（如TXNDC5，表达量增加18.5倍）、下调121个基因（如LMO2，表达量降低79%）。
     
   • 基因本体（GO term）分析表明，GO干扰了脂质代谢相关通路（如胆固醇转运调控、脂肪酸β氧化抑制），KEGG通路分析提示内质网蛋白加工通路（ko04141）可能被激活。

3. 脂质组学检测

   • 超高效液相色谱-质谱（UPLC-Q-Exactive Orbitrap）分析显示，GO剂量依赖性增加神经酰胺（Ceramide, Cer）等6类脂质，而双甲基磷脂酸（Bis-Methyl Phosphatidic Acid, Bismepa）等6类脂质减少。内质网应激抑制剂4-PBA可逆转GO诱导的脂质变化。

4. 内质网应激验证

   • 蛋白质印迹（Western blot）证实GO激活了GRP78-IRE1α-XBP-1轴：50 μg/mL GO使GRP78蛋白表达显著升高，IRE1α和XBP-1水平增加，而4-PBA可部分或完全抑制这些效应。

主要结果与逻辑关系
- 细胞毒性：GO通过诱导神经元死亡相关基因（如GO:0070997）降低类器官存活率，但未显著增加超氧化物（DHE染色阴性），提示非氧化应激机制。
- 脂质代谢紊乱：转录组学发现脂质代谢通路异常，脂质组学进一步验证了Cer等脂类的积累，且与ER应激标志物（GRP78、IRE1α）的激活一致。
- 机制验证：4-PBA抑制ER应激后，脂质谱恢复，证实GO通过ER应激途径破坏脂质稳态。

结论与价值
本研究首次在3D人脑类器官模型中揭示了GO通过ER应激（IRE1α/XBP-1轴）干扰脂质代谢的机制，为评估GO的神经毒性提供了更接近人类生理的模型。科学价值在于：
1. 证明了3D类器官在纳米毒理学研究中的优势；
2. 明确了ER应激是GO神经毒性的关键通路；
3. 为GO在生物医学应用中的安全性评估提供了数据支持。

研究亮点
1. 模型创新：采用人iPSC衍生的3D脑类器官，优于传统2D模型和动物实验。
2. 多组学整合：结合转录组学和脂质组学，系统性解析GO的分子机制。
3. 机制深度：发现ER应激是GO干扰脂质稳态的核心环节，并通过抑制剂反向验证。

其他发现
- GO未显著诱发自噬（LC3B、ATG5等标志物无变化），提示其毒性机制可能独立于自噬途径。
- 大尺寸GO（500-5000 nm）的毒性效应可能与既往报道的小尺寸GO不同，需进一步研究尺寸依赖性。

该研究为纳米材料的神经毒性评估提供了新范式，并强调了类器官模型在环境毒理学中的潜力。