人类阿尔茨海默病大脑的空间蛋白质组学分析实现微环境依赖的小胶质细胞状态鉴定
主要作者与发表信息
本研究由Paula Sanchez-Molina、Dennis-Dominik Rosmus、Dillon Brownell等人共同完成，通讯作者为Oliver Braubach和Bahareh Ajami。研究团队来自世界多家研究机构，包括德国莱比锡大学、美国俄勒冈健康与科学大学等。该研究成果于2026年5月18日在线发表于《自然·神经科学》（nature neuroscience）杂志第29卷第1599至1614页。
研究背景与目的
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种以细胞外β-淀粉样蛋白（amyloid-β, Aβ）沉积形成的神经炎性斑块、细胞内过度磷酸化tau蛋白积聚形成的神经原纤维缠结以及炎症为特征的异质性神经退行性疾病，这些病理改变最终导致神经变性。AD的病理生物学特征涉及分子、细胞和组织层面的复杂相互作用，几乎涉及每一种主要脑细胞类型。先前的研究表明，疾病相关的转录变化在AD早期阶段即具有细胞类型特异性。因此，理解单个细胞类型的特征，如其形态、分子表型以及与其他细胞的通讯，对于开发AD实验模型和治疗方法至关重要。
疾病相关小胶质细胞（disease-associated microglia, DAM）状态被认为参与AD进展，但由于现有技术的局限性，对这些细胞状态及其与病理关系的全面表征仍面临巨大挑战。传统的单细胞技术如流式细胞术、质谱流式技术（CyTOF）或单细胞RNA测序（scRNA-seq）需要对组织进行解离，无法评估细胞间相互作用或细胞与AD病理特征（如异常细胞外蛋白聚集体）的相互作用。此外，虽然空间转录组学技术具有重要价值，但其无法在单细胞水平提供深入的蛋白质组信息。常规免疫组织化学分析虽然是结合蛋白质表达与空间背景的标准方法，但其能检测的标记物数量极为有限。为了克服这些障碍，本研究团队开发了一种名为CODEX-CNS的新技术，旨在实现对福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）人类大脑样本的高参数、单细胞分辨率空间蛋白质组学分析。
研究的详细工作流程
本研究构建了一整套完整的分析流程，主要分为四个步骤：CODEX-CNS技术的开发与优化、细胞分割与注释、多维度细胞聚类分析以及独立队列验证。
第一步：CODEX-CNS技术的开发与抗体组合设计
为克服人类大脑组织普遍存在的高自发荧光和复杂细胞形态带来的挑战，研究团队对标准的CODEX（co-detection by indexing）技术进行了重大改进。他们增加了一个关键的预处理步骤：将FFPE组织切片浸泡在4.5%的过氧化氢（H₂O₂）溶液中，同时使用广谱LED光源进行照射。研究数据表明，经过此处理后，未经处理的FFPE脑组织所呈现的强烈自发荧光和可见脂褐质颗粒显著减少，信噪比因而显著提高。
在此技术平台上，团队设计了一个包含32种抗体的检测组合，用于靶向神经元、神经胶质细胞、脑血管系统、外周免疫细胞以及与AD相关的病理特征。研究总共纳入了51例样本，包括最初使用CODEX-CNS分析的16例样本（8例AD患者和8例健康对照的额叶皮层样本，分两批进行：一批4对用于发现，另一批4对用于验证），以及后续在两个独立实验室使用常规免疫荧光（immunofluorescence, IF）技术进行验证的35例样本（26例AD和25例健康对照）。
第二步：细胞分割与脑区识别
由于大脑细胞的复杂形态（如突起）超出了传统细胞核分割方法的能力，本研究采用了一种基于机器学习的细胞实例分割方法。该分割使用Ariadne.ai空间平台提供的预训练卷积神经网络深度学习模型，利用神经元核抗原（NeuN）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、离子钙结合衔接分子1（Iba1）和Olig2等标志物，分别精准地分割出神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和少突胶质细胞/少突胶质前体细胞（OPCs）的胞体和突起。在初始数据集中，共成功分割出471,181个细胞，并清晰地区分了灰质（gray matter, GM）、白质（white matter, WM）和脑膜区域，甚至能可视化不同皮层层次和包括星形胶质细胞终足、周细胞、内皮细胞紧密连接在内的血脑屏障精细结构。
第三步：多维度细胞聚类与空间邻域分析
研究团队对分割出的Iba1阳性（Iba1+）髓系细胞进行了三个维度的深入分析。
1. 形态学聚类分析： 基于12个形态学参数（如细胞面积、周长、圆度、实心度、突起数量、分支数、突起长度等）进行无监督Leiden聚类。分析识别出三大类形态：圆形、中间型和分枝型。分枝型细胞进一步被细分为三个亚群，这些亚群在细胞和胞体大小、胞体圆度、突起数量与长度上各有差异。不同形态亚群在脑内分布不同，如中间型在WM中更普遍，而某些分枝型则在GM中更普遍。
2. 蛋白质表达聚类分析： 基于Iba1、TMEM119、CD163、CD68、CD11c、HLA-DR等10种蛋白质表达水平进行无监督Leiden聚类。分析识别出五个蛋白质特征不同的亚群：单核细胞（monocytes, MO）、血管周巨噬细胞（perivascular macrophages, PVMs）、边界相关巨噬细胞样小胶质细胞（border-associated macrophage-like microglia, BLM）、小胶质细胞1（microglia 1, MG1）和小胶质细胞2（microglia 2, MG2）。其中，BLM亚群独特地共表达了小胶质细胞标志物TMEM119和边界相关巨噬细胞标志物CD163。MG1和MG2是所有样本中最丰富的亚群，但MG2在GM中占主导，而MG1在WM中占主导。
3. 空间邻域聚类分析： 这是本研究的核心创新点之一。研究团队不仅分析了细胞“自身”的特征，还分析了细胞“周边”的环境。具体而言，他们量化了每个髓系细胞中心点30微米半径范围内多种蛋白质的表达百分比，并以此为依据对AD患者GM中的13,444个Iba1+细胞进行了无监督聚类分析，最终得到16个基于微环境的细胞簇。这些簇分别表现出与神经元成分、星形胶质细胞（如簇4特异性关联GFAP）、血管、弥漫性Aβ斑块（簇9）或致密性Aβ斑块（簇15）的显著空间关联。
详细研究结果
1. 健康大脑的细胞互作基础及AD中的改变
利用CODEX-CNS同时检测多种细胞类型的能力，研究首先描绘了健康人脑和AD大脑的细胞间通讯图谱。通过分析细胞中心点15微米半径内的细胞接触频率，结果显示在健康人额叶皮层GM中，神经元与少突胶质细胞/OPCs、小胶质细胞与星形胶质细胞、以及小胶质细胞和星形胶质细胞与血管之间存在优先接触。
在AD大脑中，这些细胞互作模式发生了显著改变： * 小胶质细胞-小胶质细胞互作增强： AD大脑GM中的小胶质细胞间接触频率显著高于对照组。与不互相接触的小胶质细胞相比，这些聚集的小胶质细胞表达更高水平的CD163和HLA-DR，但增殖标志物PCNA未见显著差异，提示这种聚集可能是由病理性信号诱导的细胞迁移所致，而非局部增殖。 * 星形胶质细胞-神经元互作增强： AD大脑GM中观察到星形胶质细胞与神经元、少突胶质细胞间互作增多的趋势。重要的是，与星形胶质细胞接触的神经元表现出更高水平的DNA损伤标志物γH2A.X，这提示星形胶质细胞可能在AD背景下与受损神经元进行通讯。
2. 形态、蛋白质表型和微环境的高度关联性
研究揭示了细胞形态、蛋白质表达与其所处微环境之间存在密切的关联。 * 形态与环境的关联： 圆形形态的髓系细胞在GM和WM中均与血管标志物和PCNA显著相关。一种被称为“分枝3型”的高度分枝形态的小胶质细胞在健康对照的GM中与神经元标志物NeuN相关，但在AD患者中，这种关联消失，取而代之的是另一种“分枝2型”形态的细胞与Aβ、载脂蛋白E（APOE）及NeuN显著相关，提示这类细胞可能参与AD病理。 * 蛋白质表型与环境的关联： PVM的定位如其名，与血管标志物正相关。MG1与神经元标志物正相关。最引人注目的是，BLM亚群在AD大脑的GM中与Aβ、APOE和GFAP（反应性星形胶质细胞标志物）具有显著的统计学关联。这表明BLM细胞会迁移至Aβ斑块部位，或Aβ斑块在其周围形成。 * BLM的血管和斑块双重关联及伪时间分析： 邻域分析和距离分析共同证实，BLM不仅是距离血管最近的实质髓系亚群，而且在AD大脑中与致密性Aβ斑块形成了最强的空间关联（在0-5微米距离内，约40%的细胞为BLM）。伪时间分析表明，PVM和MG2之间存在着一条发育轨迹，而BLM可能代表这条轨迹上的一个介于PVM-样和MG2-样表型之间的过渡状态。此外，在人类诱导多能干细胞（iPSC）来源的小胶质细胞中，用Aβ刺激并不能上调CD163基因的表达，这进一步暗示了人类大脑中BLM的一个可能来源是浸润的PVM，而非由局部小胶质细胞在Aβ刺激下转化而来。
3. 发现全新的AD相关微环境特异性髓系细胞亚群——hpam
基于空间邻域的聚类分析是本研究最显著的突破。在得到的16个微环境簇中，簇15 表现出最独特和与疾病最相关的特征： * 微环境特征： 该簇细胞的周围不仅有高含量的Aβ，同时显著聚集了APOE和反应性星形胶质细胞标志物GFAP和波形蛋白（Vimentin），代表了其与APOE阳性致密性Aβ斑块和周围反应性星形胶质细胞的紧密空间关系。 * 蛋白质表达特征： 组成簇15的细胞具有独特的蛋白质表型组合，即高表达CD68（吞噬功能）、CD11c（DAM标志物）、HLA-DR（抗原呈递）、CD45（泛白细胞标志物）以及高水平的CD163（BAM标志物），同时表现为较低的TMEM119（稳态小胶质细胞标志物）表达水平。 * 形态学特征： 这些细胞在所有簇中表现出最大的细胞和胞体面积，以及最厚的突起。 * 与斑块类型的精确关系： 距离分析精确显示，簇15是所有微环境簇中距离致密性Aβ斑块最近的细胞群。 * 疾病特异性与验证： 研究团队将簇15命名为人类斑块相关小胶质细胞（human plaque-associated microglia, hpam）。此亚群在AD患者大脑中的丰度显著高于健康对照，而在健康对照脑中极少发现的hpam细胞，其周围也缺乏Aβ和反应性星形胶质细胞成分。通过使用独立的验证队列和常规IF染色，研究证实了在致密性Aβ斑块附近确实存在CD11c阳性和TMEM119低表达的髓系细胞，而在同一AD样本中远离斑块的细胞以及健康对照样本的细胞则不表现此特征。机器学习预测模型也证实，结合蛋白质表达和微环境信息最能准确预测致密性Aβ斑块的存在，而CD11c和CD68表达是其中相关性最强的单个预测因子。
研究结论与价值
本研究成功开发并应用了CODEX-CNS技术平台，这是一种能够在FFPE人类大脑组织中同时实现单细胞水平蛋白质组、形态学和空间微环境分析的新型工具。通过对AD患者和健康对照额叶皮层的分析，本研究得出以下核心结论：
本研究的科学价值在于，它提供了一种全新的、强大的研究范式，即通过同时整合蛋白质、形态和空间背景信息来解析人脑在健康和疾病状态下的细胞复杂性，这为理解AD等神经系统疾病的细胞机制提供了前所未有的分辨率。其应用价值在于，CODEX-CNS平台可用于未来探究特定细胞亚群（如hpam）在Aβ清除中的确切作用，并可能促进针对这些细胞状态的新的治疗策略的开发。
研究亮点