本研究由Ninaad Lasrado（第一作者）、Nicholas Borcherding、Rajkumar Arumugam、Timothy K. Starr 和Jay Reddy（通讯作者，University of Nebraska-Lincoln）等学者共同完成，并于2022年3月18日发表在开放获取期刊《iScience》上（文章题目：Dissecting the cellular landscape and transcriptome network in viral myocarditis by single-cell RNA sequencing）。这篇论文首次系统性地运用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，深入解析了病毒感染后心肌炎（病毒性心肌炎）小鼠模型心脏组织的细胞构成、转录组网络及细胞间通讯，为理解慢性病毒性心肌炎向扩张型心肌病（Dilated Cardiomyopathy, DCM）发展的复杂病理机制提供了全新的视角。
这项研究属于免疫学和心血管疾病研究的交叉领域。病毒，特别是柯萨奇病毒B3型（Coxsackievirus B3， CVB3），是引发心肌炎的主要病原体。尽管多数患者可自愈，但约20%的病例会发展为慢性心肌炎并最终导致DCM，而目前尚缺乏有效治疗方法。CVB3感染小鼠是研究该疾病的标准模型。此前的研究表明，免疫细胞和非免疫细胞（如成纤维细胞）在疾病进程中均扮演了重要角色，但其具体的细胞组成、各细胞亚群的功能状态以及在慢性期如何相互作用导致心脏重塑和功能障碍，仍不甚明了。因此，本研究旨在通过scRNA-seq这一前沿技术，全面描绘健康与心肌炎小鼠心脏细胞的单细胞图谱，鉴定参与疾病进展的关键细胞类型、基因表达特征、转录因子和信号通路，从而揭示潜在的致病机制和治疗靶点。
研究的具体工作流程系统且严谨，主要包含以下几个关键步骤：首先，建立动物模型。研究者使用高致病性的Nancy株CVB3感染高度敏感的A/J小鼠，并设置未感染的健康小鼠作为对照。在感染后第21天（处于慢性或感染后阶段），采集小鼠心脏组织。其次，制备单细胞悬液并进行分选。将心脏组织进行酶消化以获得单细胞悬液，然后使用流式细胞术，通过Annexin-V和碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色，分选出具有活性的细胞（Annexin-V-PI-），确保后续测序数据的质量。第三，单细胞文库构建与测序。将分选出的约16,000个活细胞（来自心肌炎组和健康组）加载到10x Genomics Chromium平台，构建单细胞cDNA文库并进行高通量测序。第四，生物信息学分析与数据挖掘。这是本研究的核心。研究者主要利用Seurat R软件包对总计22,985个细胞（健康组9,734个，心肌炎组13,251个）进行降维、聚类和细胞类型注释。他们采用了双重策略：一是使用SingleR R包，将细胞簇的基因表达谱与ImmGen数据库中的纯化小鼠免疫细胞参考谱进行相关性比对，以预测细胞类型；二是利用经典的细胞谱系标记基因（如Cd3e、Cd4、Cd8a、Col1a1、Cd68等）的表达模式进行手动验证和最终注释。随后，研究者对鉴定出的主要细胞类群（如髓系细胞、T细胞、成纤维细胞）进行了独立的再聚类和深入分析。这包括使用Slingshot算法推断细胞发育轨迹和伪时间分析，使用Wilcoxon秩和检验进行差异基因表达分析，使用Gene Ontology（GO）和基因集富集分析（GSEA）探究富集的生物学通路，并利用CellChat R软件包基于已知的2,021个已验证的配体-受体对数据库，系统分析了细胞间通讯网络的变化。此外，还应用了SCENIC（单细胞调控网络推断和聚类）算法来鉴定调控差异基因表达的关键转录因子。整个分析流程全面，从细胞组成、亚群异质性、功能状态到细胞互作和调控网络，层层递进。
研究获得了一系列丰富且具有重要发现意义的结果。在细胞组成层面，scRNA-seq分析成功鉴定了心脏组织中的12种主要细胞类型。与健康小鼠相比，心肌炎小鼠心脏浸润细胞中，髓系细胞（Myeloid cells）、T细胞和成纤维细胞（Fibroblasts）的比例显著增加，而B细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和先天淋巴样细胞（ILCs）的比例减少。这表明前三种细胞类型可能是介导慢性病毒性心肌炎病理过程的核心参与者。对髓系细胞的深入分析显示，其主要由单核细胞和巨噬细胞组成，并且呈现出显著的异质性。重要的是，多个髓系细胞亚群（特别是单核细胞和巨噬细胞）高表达M2型巨噬细胞的标志物（如Ccl24、Arg1、Chil3），提示它们在感染后阶段可能主要发挥抗炎和组织修复功能，而非经典的促炎（M1型）作用。然而，也同时检测到一些M1相关基因（如Ccl2）的上调，表明存在混合表型。轨迹分析表明，这些髓系细胞主要来源于单核细胞，并由抗炎硒蛋白Msrb1驱动其分化。GO分析进一步揭示了这些细胞中氧化磷酸化等代谢通路的上调，这与M2细胞的功能特征相符。这些结果共同指向髓系细胞在慢性期可能通过促进修复和纤维化参与心脏重塑。
对T细胞的精细分群揭示了更为复杂的图景。心肌炎小鼠心脏中富集的主要是Th17细胞、细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocytes, CTLs）和调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）。令人意外的是，差异基因表达分析发现，不仅是CTLs，CD4+ T细胞（包括Th17和Treg亚群）也高表达与细胞毒性功能相关的基因，如Nkg7和Prf1（穿孔素）。此外，多个T细胞亚群还普遍上调了钙结合蛋白基因（如S100a4, S100a6, S100a11），这些基因与组织修复、纤维化及T细胞耗竭有关。轨迹分析显示，T细胞亚群从初始CD4+ T细胞和中央记忆CD8+ T细胞分支演化而来。GO分析表明，这些T细胞主要富集于免疫代谢、T细胞活化、细胞因子产生以及细胞毒性等相关通路。这些发现暗示，在慢性心肌炎阶段，浸润的T细胞，无论其传统分类如何，都可能具有强烈的细胞毒性潜能，这种功能可能既用于清除残留病毒，也可能导致自身免疫性组织损伤。同时，Tregs的出现可能旨在抑制过度的炎症反应，但其同样表达细胞毒性分子，其功能复杂性有待进一步研究。
成纤维细胞的分析是另一个亮点。研究者鉴定出12个具有异质性的成纤维细胞亚群，其中多个亚群（特别是簇5、6、8）在心肌炎小鼠中显著扩增。这些亚群表达不同的基因特征，提示其功能的多样性。例如，一些亚群高表达与心脏纤维化、细胞外基质重塑相关的基因，如Postn（骨膜蛋白）、Ltbp2、Thbs4、Tgfb1和Apoc。值得注意的是，在簇8（Wif1+成纤维细胞）中，研究者发现Wif1（Wnt抑制因子）的表达与两个新基因Cyb5a（细胞色素b5a）和Fxyd6的表达呈正相关，提示后两者可能作为潜在的新型心脏损伤标志物。GO分析证实，这些成纤维细胞不仅参与细胞外基质组织、伤口愈合和纤维化，还积极调控炎症和免疫反应。这打破了成纤维细胞仅作为“结构细胞”的传统认知，揭示了其在免疫调节中的主动角色。
此外，研究还分析了其他细胞类型。例如，中性粒细胞在心肌炎中表现出功能异质性，其中一个亚群高表达Il1b，提示其可能通过释放IL-1β促进心脏纤维化和重塑，这与IL-1β在心肌炎中的已知致病作用相符。B细胞数量稀少且转录组无显著变化，暗示其在慢性阶段的直接作用可能有限。最后，研究者利用CellChat工具构建了心脏“细胞组”（cellulome）的细胞间通讯网络。分析发现，在心肌炎状态下，成纤维细胞与T细胞（CD4+和CD8+）、髓系细胞与平滑肌细胞之间的相互作用显著增强。信号通路分析则识别出多个在心肌炎中特异性上调的途径，如EGF、LCK、非经典Wnt、OSM、Notch和PDGF通路，这些通路已知参与CVB3复制、心脏修复、纤维化和重塑过程。例如，PDGF信号在成纤维细胞中呈自分泌模式，且其配体Tgfb1在髓系细胞中上调，共同指向一个促纤维化的微环境。通过SCENIC分析，研究者鉴定出在心肌炎T细胞中上调的关键转录因子Ets1，以及在髓系细胞中上调的Irf5和Mafb。这些转录因子调控着大量与心脏缺血、重塑、心力衰竭以及M2表型相关的靶基因，是潜在的疾病调控枢纽。
基于以上结果，本研究得出重要结论：在CVB3诱导的慢性（感染后）心肌炎阶段，心脏浸润细胞主要由具有特定功能状态的髓系细胞（M2表型为主）、T细胞（Th17、CTLs、Tregs，均具细胞毒性特征）和异质性成纤维细胞（促纤维化与免疫调节）构成。这些细胞并非孤立行动，而是通过复杂的配体-受体相互作用网络进行交流，共同塑造了一个促进炎症、纤维化和心脏重塑的微环境，从而推动了疾病向DCM的进展。研究中鉴定出的新型标志物（如Fxyd6, Cyb5a）、关键信号通路（如PDGF, Notch）和核心转录因子（如Ets1, Irf5, Mafb）为未来开发针对病毒性心肌炎及继发性DCM的诊断方法和靶向治疗提供了宝贵的线索和潜在靶点。
本研究的亮点在于其创新性和系统性：首先，这是首次运用scRNA-seq技术全面绘制病毒性心肌炎心脏细胞图谱的研究，填补了该领域空白。其次，研究不仅描述了细胞组成，还深入揭示了各细胞亚群的功能状态、异质性及其在慢性期的独特角色（如具有细胞毒性的CD4+ T细胞和Tregs，以及免疫活性的成纤维细胞）。第三，整合了细胞轨迹、细胞互作网络和转录因子调控网络等多层次分析，构建了一个从分子到细胞再到微环境的综合病理机制框架。第四，发现了多个新的潜在生物标志物（Fxyd6, Cyb5a）和治疗靶点（如Ets1）。
当然，研究也存在一定局限性，如仅分析了感染后单一时间点，未能动态展示疾病全过程的细胞演变；由于技术限制（细胞大小和分离方法），未能捕获和分析心肌细胞这一关键靶细胞的转录组；此外，大部分基于生物信息学的发现有待后续通过基因敲除动物模型或药理学手段进行功能验证。尽管如此，这项研究无疑为理解病毒性心肌炎的复杂发病机制建立了新的里程碑，其提供的丰富数据资源和高维视角，将极大地推动该领域的基础研究和转化医学探索。