右美托咪定通过调控FKBP12.6/RyR2信号通路保护H9c2心肌细胞对抗氧糖剥夺/复氧诱导的细胞内钙超载与凋亡
一、 研究作者、机构与发表信息
本项原创性研究的主要作者包括袁梅（Mei Yuan）、蒙晓雯（Xiao-Wen Meng）、马娇（Jiao Ma）、刘宏（Hong Liu）、宋绍勇（Shao-Yong Song）、陈庆才（Qing-Cai Chen）、刘华月（Hua-Yue Liu）、张娟（Juan Zhang）、宋楠（Nan Song）、季福海（Fu-Hai Ji）和彭科（Ke Peng）。作者单位主要来自中国苏州大学第一附属医院麻醉科（Department of Anesthesiology, First Affiliated Hospital of Soochow University），此外还包括南京医科大学附属苏州医院麻醉科以及美国加州大学戴维斯分校健康系统麻醉与疼痛医学科。
该研究成果发表于学术期刊 Drug Design, Development and Therapy，发表时间为2019年。该期刊是Dove Medical Press旗下的同行评审开放获取期刊。
二、 研究的学术背景与目的
本研究隶属于心血管药理学与心肌缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion, I/R）损伤保护领域。心肌I/R损伤是缺血性心脏病患者及心脏手术后发病和死亡的主要因素。在I/R损伤的复杂机制中，细胞内钙离子（[Ca2+]i）超载是一个关键环节，它会导致心肌细胞凋亡和死亡。
右美托咪定（Dexmedetomidine, Dex）是一种高选择性的α2-肾上腺素受体激动剂，具有镇静、抗焦虑、镇痛和抑制交感神经活性的特性。前期临床和动物研究表明，Dex的使用与心脏手术患者预后改善相关，并能减轻大鼠心肌I/R损伤，其机制可能与抗炎作用有关。此外，有研究提示Dex能影响背根神经节细胞的钙信号。然而，Dex是否通过调节钙信号通路来发挥心脏保护作用，尚不完全清楚。
FK506结合蛋白12.6（FKBP12.6，亦称Calstabin-2）是调节心脏肌浆网（Sarcoplasmic Reticulum, SR）钙释放的关键蛋白，通过与心脏兰尼碱受体2（Ryanodine Receptor 2, RyR2）结合，稳定RyR2通道，防止钙泄漏。在心力衰竭等病理状态下，FKBP12.6与RyR2的结合减少。RyR2的磷酸化，特别是其第2814位丝氨酸（Ser2814）的磷酸化，是调节通道功能的关键。心肌I/R时，RyR2-Ser2814磷酸化水平增加，导致钙释放异常和[Ca2+]i超载，进而激活包括Caspase-3在内的凋亡执行通路。
基于以上背景，本研究旨在利用H9c2心肌细胞构建的氧糖剥夺/复氧（Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation, OGD/R）模型（模拟心肌I/R的体外模型），探究以下科学问题：Dex预处理是否能保护心肌细胞对抗OGD/R损伤？其保护作用是否与缓解[Ca2+]i超载和抑制细胞凋亡有关？其潜在机制是否涉及对FKBP12.6/RyR2信号通路的调控？ 研究假设是：Dex可能通过调控FKBP12.6/RyR2信号通路，减轻OGD/R诱导的[Ca2+]i超载和Caspase-3依赖性凋亡，从而发挥心肌保护作用。
三、 详细研究流程与方法
本研究设计严谨，包含多个连续的实验流程，以验证假设。
1. 细胞培养与OGD/R模型建立： 研究使用大鼠胚胎心脏来源的H9c2心肌细胞系。细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37°C、5% CO2条件下培养。实验采用OGD/R模型模拟I/R损伤：细胞换用无糖DMEM培养基，置于缺氧小室（95% N2, 5% CO2）中培养12小时（OGD期），随后更换为正常含糖培养基，在正常氧条件下再培养3小时（复氧期）。
2. 实验分组与Dex浓度筛选： 为确定Dex的有效浓度，研究设置了5个组：对照组（正常培养）、OGD/R组（仅接受OGD/R处理）、以及三个Dex预处理组（在OGD/R处理前1小时，分别用0.1、1和10 μM的Dex孵育细胞）。Dex浓度基于作者团队前期的研究设定。通过细胞形态学观察、MTT法检测细胞活力、乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测细胞毒性，确定了1 μM Dex为后续实验的最佳预处理浓度。
3. 核心机制探究实验： 在确定1 μM Dex的有效性后，研究深入探究其保护机制，主要流程包括： * 检测[Ca2+]i水平： 使用膜渗透性荧光钙离子指示剂Fluo-3/AM染色，通过荧光显微镜观察并定量分析各组细胞的荧光强度，反映[Ca2+]i水平变化。 * 检测FKBP12.6/RyR2表达： 采用实时定量PCR（RT-qPCR）检测FKBP12.6和RyR2的mRNA水平；采用蛋白质印迹法（Western Blot）检测FKBP12.6、总RyR2蛋白、磷酸化RyR2（p-Ser2814-RyR2）蛋白的表达量，并计算p-Ser2814-RyR2与总RyR2的比值。 * 检测细胞凋亡： 使用Hoechst 33258染色，在荧光显微镜下观察细胞核形态（浓缩、碎裂为凋亡特征），并计算凋亡率。同时，通过Western Blot检测凋亡关键执行蛋白Caspase-3及其活化形式（Cleaved Caspase-3）的表达，并计算Cleaved Caspase-3与总Caspase-3的比值。
4. 基因敲低验证实验（功能挽救实验）： 为了确证FKBP12.6在Dex保护作用中的必要性，研究采用了小干扰RNA（siRNA）敲低FKBP12.6的表达，进行功能丧失性实验。这是验证因果关系的强有力手段。 * siRNA筛选与敲低效率验证： 首先，设计了三条针对大鼠FKBP12.6的siRNA序列（si-88, si-153, si-240）以及阴性对照序列。将siRNA转染至H9c2细胞24或48小时后，通过RT-qPCR和Western Blot筛选敲低效率最高的siRNA（最终选定si-88，转染48小时）。 * 敲低后的功能实验： 设置6个实验组：对照组、OGD/R组、Dex+OGD/R组、si-FKBP12.6 + Dex + OGD/R组、Vehicle（转染试剂对照）+ Dex + OGD/R组、Mismatch（错义序列对照）+ Dex + OGD/R组。在si-FKBP12.6组中，先转染si-FKBP12.6敲低基因表达，再进行Dex预处理和OGD/R。随后，在这些组中重复检测：细胞活力（MTT）、细胞毒性（LDH）、[Ca2+]i水平（Fluo-3/AM）、p-Ser2814-RyR2表达（Western Blot）、细胞凋亡率（Hoechst）以及Cleaved Caspase-3表达（Western Blot）。
5. 数据分析方法： 所有数据使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。数据正态性采用Shapiro-Wilk检验。符合正态分布的数据以均数±标准误表示，采用单因素或双因素方差分析，事后检验选用Bonferroni或Dunnet法；非正态分布数据以中位数（四分位距）表示，采用非参数Mann-Whitney U检验。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。
四、 主要研究结果及其逻辑关联
1. Dex预处理减轻OGD/R诱导的H9c2细胞损伤： 与对照组相比，OGD/R处理导致细胞形态变圆、折光性下降，细胞活力显著降低（降至对照组的52.9%），LDH释放显著增加（增至对照组的205.6%）。1 μM和10 μM Dex预处理能显著改善细胞形态，提高细胞活力（分别恢复至对照组的76.2%和75.7%），降低LDH释放（分别降至对照组的138.0%和138.8%），且两者效果相当。0.1 μM Dex效果不显著。该结果确定了Dex的保护作用及其有效浓度（1 μM），为后续机制研究奠定了基础。
2. Dex抑制OGD/R诱导的[Ca2+]i超载： Fluo-3/AM荧光检测显示，OGD/R组细胞的[Ca2+]i水平显著升高（是对照组的1.76倍）。1 μM和10 μM Dex预处理能有效阻断这种升高（分别降至对照组的1.25和1.21倍）。在正常培养条件下，Dex本身对[Ca2+]i水平无影响。该结果将Dex的保护作用与钙稳态联系起来，提示其可能通过调节钙信号发挥作用。
3. Dex调控OGD/R期间FKBP12.6/RyR2信号通路： * FKBP12.6表达下调被逆转： OGD/R导致FKBP12.6的mRNA和蛋白表达均显著下调（蛋白降至对照组的0.59倍）。1 μM Dex预处理能显著逆转这种下调，使其表达恢复至接近正常水平（蛋白恢复至对照组的0.83倍）。 * RyR2-Ser2814磷酸化水平升高被抑制： 总RyR2蛋白表达在OGD/R及Dex处理后均无显著变化。然而，OGD/R显著增加了p-Ser2814-RyR2蛋白的表达及其与总RyR2的比值。Dex预处理能显著抑制这种磷酸化水平的升高。 * 逻辑关联： 这些结果表明，OGD/R破坏了FKBP12.6/RyR2复合体的稳定性（FKBP12.6减少，RyR2磷酸化增强），这通常与RyR2通道稳定性下降、钙泄漏增加相关。Dex预处理能正向调控这一通路，稳定RyR2通道，这为解释其抑制[Ca2+]i超载提供了直接的分子机制证据。
4. Dex减少OGD/R诱导的Caspase-3依赖性细胞凋亡： Hoechst染色显示，OGD/R组细胞凋亡率显著升高（达54.0%），1 μM和10 μM Dex预处理可显著降低凋亡率（分别降至28.3%和28.6%）。Western Blot结果显示，OGD/R上调了Cleaved Caspase-3蛋白表达及其与总Caspase-3的比值，而Dex预处理能抑制这种上调。总Caspase-3表达无变化。该结果证实Dex能抑制OGD/R诱导的细胞凋亡，并将凋亡执行分子Caspase-3的激活与Dex的保护效应联系起来。
5. 敲低FKBP12.6可消除Dex的保护作用（功能验证）： 这是本研究最关键的机制验证环节。 * 消除细胞保护效应： 在转染si-FKBP12.6成功敲低FKBP12.6表达后，Dex预处理对OGD/R引起的细胞活力下降和LDH释放增加的改善作用被完全抵消。 * 消除对钙信号的调控： si-FKBP12.6阻断了Dex对[Ca2+]i超载的抑制作用，并且逆转了Dex对p-Ser2814-RyR2磷酸化水平的抑制效应。 * 消除抗凋亡效应： si-FKBP12.6也废除了Dex对细胞凋亡率升高以及Cleaved Caspase-3表达增加的抑制作用。 * 逻辑关联： 这一系列“功能挽救”实验提供了强有力的因果证据。它表明，FKBP12.6是Dex发挥其保护作用（包括缓解钙超载和抑制凋亡）所必需的中间分子。如果FKBP12.6被敲低，即使有Dex存在，其保护链条也被打断，细胞损伤依旧发生。这直接证实了“Dex → FKBP12.6 → 稳定RyR2/减少磷酸化 → 减轻钙超载 → 抑制Caspase-3凋亡”这一信号轴的存在。
五、 研究结论与价值意义
本研究得出结论：右美托咪定（Dex）预处理能够保护H9c2心肌细胞对抗OGD/R（模拟I/R）损伤。其保护机制在于：Dex通过上调FKBP12.6的表达并抑制RyR2-Ser2814位点的磷酸化，从而稳定RyR2通道，减轻细胞内钙离子（[Ca2+]i）超载，进而抑制了Caspase-3依赖性的细胞凋亡通路。FKBP12.6是介导Dex这一保护作用的关键蛋白。
科学价值： 1. 揭示了Dex心脏保护的新机制： 首次在心肌细胞层面系统阐明了Dex通过FKBP12.6/RyR2信号轴调节钙稳态和凋亡的分子机制，丰富了对其器官保护作用的理解，超越了传统的抗炎机制。 2. 明确了FKBP12.6的关键作用： 通过siRNA敲低实验，确证了FKBP12.6是Dex发挥保护效应的必要环节，提示FKBP12.6可能成为防治心脏I/R损伤的一个潜在治疗靶点。 3. 连接了钙信号与凋亡通路： 研究清晰展示了从钙通道调控（FKBP12.6/RyR2）到钙超载，再到下游凋亡执行蛋白（Caspase-3）激活的完整病理生理和药物干预链条。
应用价值： 为临床上使用右美托咪定预防高危患者（如接受心脏手术、存在心肌缺血风险的患者）的心肌缺血/再灌注损伤提供了重要的实验依据和理论支持。研究表明，在缺血事件发生前给予Dex（预处理），可能通过稳定心肌细胞钙处理能力，减轻细胞死亡，从而改善预后。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容与局限性讨论
研究在讨论部分也客观指出了其局限性： 1. 未检测FKBP12.6与RyR2的直接结合： 虽然检测了二者的表达和磷酸化，但未使用免疫共沉淀技术直接验证Dex是否影响FKBP12.6与RyR2的物理结合。 2. 未涉及其他钙调控机制： 研究聚焦于RyR2介导的钙释放，但肌浆网钙泵（SERCA）介导的钙重吸收也是调节钙稳态的重要环节，此途径未被探讨。 3. 体外研究的局限性： H9c2细胞系虽具心肌特性，但毕竟不是原代成年心肌细胞或整体动物模型，结论外推至活体需要谨慎。文中使用的Dex浓度（μM级）高于临床血浆浓度，作者解释这与细胞实验体系有关，不同细胞类型的安全浓度存在差异。 4. 其他潜在作用靶点： 作者提到，除α2受体外，Dex也可能直接作用于L型钙通道等其他离子通道，这些途径在本研究中未涉及，是未来可探索的方向。
尽管存在这些局限，本研究通过严谨的设计和深入的机制挖掘，为理解右美托咪定的心脏保护作用提供了重要的新见解，并为后续的动物实验和临床转化研究奠定了坚实的基础。