基于樟脑的酰肼和磺酰胺衍生物作为漆酶抑制剂抗植物病原真菌/卵菌的研究报告

作者及发表信息

本研究由南京林业大学化学工程学院的Zihui Yang、Xuebao Sun、Yigui Qiu、Daojun Jin、Yiming Zheng、Jia Li*和Wen Gu*共同完成，于2023年9月25日发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry（J. Agric. Food Chem. 2023, 71, 14151−14163）。

学术背景

研究领域：本研究属于农业化学与药物化学交叉领域，聚焦于天然产物衍生物的农药开发，具体针对植物病原真菌和卵菌的防治。

研究动机：苹果轮纹病（由Botryosphaeria dothidea引起）等真菌病害对全球农业造成严重经济损失，而现有杀菌剂（如代森锰锌、百菌清）因耐药性问题亟需新型作用机制的药剂。漆酶（laccase）是真菌黑色素合成的关键酶，参与病原菌的致病性和形态建成，但其作为杀菌剂靶点的研究尚不充分。

研究目标：设计并合成基于樟脑（camphor）的新型酰肼和磺酰胺衍生物，评估其抗真菌活性，探究漆酶抑制机制，并筛选高效低毒的候选化合物。

研究流程与方法

1. 化合物设计与合成

研究对象：设计4类共41种衍生物：
- 系列4a–4k：樟脑酸酰肼衍生物（camphanic acid hydrazide）
- 系列5a–5j：双酰肼衍生物
- 系列9a–9k：N-酰基-N’-磺酰基哌嗪衍生物
- 系列10a–10i：N,N’-二磺酰基哌嗪衍生物

合成方法：
- 关键中间体：(1S)-(−)-樟脑酸（3）通过D-樟脑（1）的两步氧化反应制备（收率35%）。
- 系列4a–4k：樟脑酸与取代苯肼或苯甲酰肼在EDCI/DMAP催化下缩合（收率60–85%）。
- 系列9a–9k：樟脑-10-磺酰氯（6）与Boc-哌嗪缩合后脱保护，再与苯甲酰氯/磺酰氯反应（收率25–93%）。
- 晶体结构验证：化合物4f通过单晶X射线衍射（CCDC 2240410）确认绝对构型为1R,4S。

2. 抗真菌活性评估

测试菌株：4种真菌（B. dothidea、Fusarium graminearum等）和3种卵菌（Phytophthora capsici等）。

实验方法：
- 体外活性：采用菌丝生长抑制法（50 mg/L浓度初筛），计算EC50值。
- 体内活性：苹果果实接种B. dothidea后，评估化合物4b的保护性和治疗性效果。

结果：
- 系列4a–4k表现最优，尤其是4b（4-氟苯基取代）对B. dothidea的EC50为1.28 mg/L，优于百菌清（8.47 mg/L）。
- 体内实验：4b在200 mg/L剂量下对苹果轮纹病的防效显著高于百菌清（p < 0.001）。

3. 作用机制研究

细胞层面：
- SEM/TEM观察：4b（2×EC50）导致B. dothidea菌丝表面皱缩、线粒体结构破坏（图6）。
- 膜通透性：4b浓度依赖性增加菌丝电导率（图7a）。
- 代谢抑制：4b降低麦角固醇（ergosterol）含量（从122.1 μg/g降至30.3 μg/g）和外多糖产量（从1.06 mg/mL降至0.05 mg/mL）。

分子靶点：
- 漆酶抑制：4b的IC50为11.3 μM，优于阳性对照半胱氨酸（35.5 μM）。
- 分子对接：4b通过氢键（与Gln169、Ser170）和疏水作用（与Leu612）嵌入漆酶活性口袋（图8）。

4. 安全性评估

急性经口毒性：大鼠LD50为849.1 mg/kg（95%置信区间：403.9–1785.3 mg/kg），属于低毒（OECD标准）。

主要结果与结论

1. 高效化合物：4b对B. dothidea、F. graminearum和P. nicotianae均表现出纳摩尔级活性（EC50 1.28–2.09 mg/L）。
   
2. 作用机制：通过破坏细胞膜完整性、抑制漆酶活性双重途径发挥抗真菌作用。
   
3. 应用价值：樟脑酸酰肼衍生物可作为靶向漆酶的新型杀菌剂先导化合物。
   

研究亮点

1. 结构创新：首次将樟脑骨架与酰肼/磺酰胺结合，发现4b的高效抗真菌活性。
   
2. 机制突破：明确漆酶抑制与细胞膜损伤的协同作用，为多靶点农药设计提供思路。
   
3. 方法学：结合晶体学（4f）和分子模拟验证靶点结合模式。
   

其他价值

本研究开发的合成路线（如EDCI/DMAP催化缩合）可推广至其他天然产物衍生物的制备，为农业抗病药物开发提供新策略。