基于CRISPR/Cas9的人视网膜类器官双报告系统鉴定并富集具有增强轴突动力学的红/绿视锥感受器前体细胞
主要作者与研究机构
本研究由威斯康星大学麦迪逊分校（University of Wisconsin-Madison）David M. Gamm 团队主导完成，第一作者为 Praveen J. Susaimanickam，合作者包括 Elizabeth Capowski、Timothy M. Gomez 等。研究发表于 Stem Cell Research & Therapy 期刊，2026年，卷17，文章编号336，DOI为10.1186/s13287-026-05128-9。Gamm 实验室长期致力于人多能干细胞（human pluripotent stem cell, hPSC）来源的视网膜类器官（retinal organoid, RO）构建及视网膜细胞替代治疗研究，在光感受器发育与移植领域具有系统积累。
研究背景
中心凹（fovea）是视网膜中直径约1.5毫米的高度特化区域，其光感受器几乎全部由长波长（红）和中波长（绿）视锥细胞（long/medium wavelength cone, L/M cone）构成。中心凹L/M视锥细胞的丢失可导致不可逆的中心视力障碍，而目前尚无有效治疗手段。人多能干细胞及视网膜类器官技术为光感受器替代治疗提供了可行途径，然而，满足中心凹重建所需的L/M视锥细胞供体必须具备充足的发育可塑性，以在宿主环境中存活、整合、成熟并建立功能连接。
此前研究已证实，晚期（>240天）人视网膜类器官中的L/M视锥细胞能够产生与成年猕猴中心凹视锥细胞相当的、波长特异性的分级光反应；但仅早期（<80天）类器官来源的视锥前体细胞表现出细胞自主的轴突延伸能力。这一现象构成核心科学矛盾：功能成熟的L/M视锥细胞不再具备轴突生成能力，而具有轴突生成能力的早期前体细胞又缺乏特异性鉴定与富集工具。因此，如何识别并分离具有内在轴突动力学优势的早期L/M视锥感受器前体细胞，成为中心凹重建策略的关键瓶颈。
甲状腺激素受体β2（thyroid hormone receptor beta 2, THRB2）在脊椎动物中是L/M视锥细胞特化的最早分子标志，其表达先于GNAT2、GNGT2、ARR3等通用视锥基因。然而，由于THRB2蛋白缺少特异性抗体，且THRB1与THRB2共享DNA结合域和配体结合域，常规报告策略难以实现亚型特异性标记。本研究旨在通过CRISPR/Cas9技术在内源性THRB2启动子控制下构建L/M视锥特异性荧光报告系统，并进一步寻找可用于细胞表面富集的分子标志。
研究设计与实验流程
研究者首先构建了双报告人多能干细胞系（L/M-CRR）。具体而言，以先前建立的WA09 NRL⁺/EGFP 视杆报告细胞系为基础，设计供体质粒包含5′同源臂（711 bp）、tdTomato-P2A转基因片段及3′同源臂（990 bp），利用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复将tdTomato-P2A序列精确插入一个内源THRB2等位基因的翻译起始位点（translation initiation site, TIS）上游。该策略确保tdTomato由内源THRB2启动子驱动，同时不破坏THRB2蛋白表达。经嘌呤霉素筛选、单克隆挑取、PCR基因分型及Sanger测序验证，获得两个正确插入的克隆（C24和C38），均通过核型分析、多能性标志物检测及脱靶筛查。之所以保留THRB2双等位基因完整性，是因为THRB配体结合域单倍剂量不足可导致甲状腺激素抵抗综合征。值得注意的是，NRL基因在人类中单倍剂量充足，故视杆报告部分不涉及类似顾虑。
随后，研究团队按照已发表的视网膜类器官分化方案将L/M-CRR细胞系分化为类器官，并设置了多个分化时间点（D30至D200）进行系统表征。活体荧光成像显示，tdTomato信号于D35–D40首次出现，先于NRL:EGFP信号（约D70–D80）。免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）证实，在D50，所有THRB2:tdTomato⁺细胞共表达全光感受器标志物恢复蛋白（recoverin, RCVRN），但不表达NRL:EGFP；在D100，tdTomato⁺细胞与视锥标志物GNAT2共定位，仍不与NRL:EGFP重合；至D175，tdTomato⁺细胞仅与L/M-视蛋白共标，不与S-视蛋白或NRL:EGFP共标。流式细胞术（flow cytometry, FC）整合中位荧光强度分析显示，tdTomato表达自D30持续上升至D100达峰，随后急剧下降，至D200接近消失。
为解析早期L/M视锥感受器前体细胞的分子特征，研究者在D50和D100对L/M-CRR类器官进行解离和荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS），获得五组细胞：D50 tdTomato⁻其他视网膜细胞、D50 tdTomato⁺早期L/M视锥感受器前体、D100 tdTomato⁻/EGFP⁻其他视网膜细胞、D100 tdTomato⁺晚期L/M视锥感受器前体和D100 NRL:EGFP⁺早期视杆前体（每组4个生物学重复）。提取RNA后进行批量RNA测序（bulk RNA-seq，Illumina NovaSeq6000，每样本3000万reads，2×150 bp），数据处理流程包括Skewer接头修剪、STAR比对至GRCh38.p10、RSEM表达定量、edgeR差异表达分析（fold change≥1.5，FDR<0.0001），随后进行K均值聚类（k=6）、基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析和基因集富集分析（GSEA）。
在功能富集分析基础之上，研究者进一步利用CD166/ALCAM表面蛋白开展磁激活细胞分选（magnetic-activated cell sorting, MACS）验证。实验采用生物素偶联CD166抗体和抗生物素微珠，经LS柱分离获得CD166阳性与阴性组分。同时，为了在全光感受器谱系中评价轴突动力学，研究者使用了源自同一WA09背景的CRX⁺/tdTomato全光感受器报告细胞系，对D50未分选及CD166 MACS分选后的光感受器前体细胞进行了轴突末端动态性定量分析。动态性测量采用时间序列成像（15分钟，3分钟间隔），通过ImageJ宏将生长锥图像二值化，帧间相减计算延伸与回缩面积，公式为（延伸面积+回缩面积）/平均末端面积。轴突长度则通过细胞体中心到末端中心的距离测量。
主要研究结果
定量RT-PCR结果显示，THRB2 mRNA在D21和D35的表达显著高于GNAT2、GNGT2和ARR3（p<0.05），至D50仍呈升高趋势，证实THRB2是最早启动的L/M视锥谱系基因。免疫染色结果严格证明THRB2:tdTomato⁺细胞仅属于L/M视锥谱系：在D175，全部70个L/M-视蛋白⁺细胞均表达tdTomato，35个S-视蛋白⁺细胞均不表达tdTomato。
RNA-seq共鉴定出1890个在至少一个阳性分选群体中上调的基因。K均值聚类（k=6）揭示了一个独特的第2簇（cluster 2），包含308个基因，仅在D50早期L/M视锥感受器前体中高表达。该簇基因分属转录因子、细胞因子/生长因子、蛋白激酶和分化簇（cluster of differentiation, CD）表面蛋白等家族，其中包括THRB本身及CD166/ALCAM。GO分析显示该簇前三位生物学过程为“无机阳离子跨膜转运”“轴突导向”和“神经肌肉过程”。更关键的是，D50与D100 tdTomato⁺细胞差异表达分析表明，早期前体的前三位GO生物学过程为“细胞迁移调控”“神经系统发育”和“轴突导向”，而晚期前体的前三位GO过程为“单原子阳离子跨膜转运”“动作电位”和“视觉感知”。这一时间性分子特征转换精确解释了早期前体细胞高轴突生成能力与晚期细胞功能成熟之间的机制基础。
CD166/ALCAM的免疫染色在D50类器官中呈特异性表达，且仅存在于约60.04%±3.58%的THRB2:tdTomato⁺细胞中。空间分布呈现明显不对称性：基底侧78.40%±7.18%的tdTomato⁺细胞表达CD166，而顶端侧仅41.68%±3.61%表达（p<0.0001）。MACS分选结果显示，CD166阳性组分中THRB2:tdTomato⁺细胞占45.55%±3.17%，阴性组分仅占6.86%±0.95%，而未分选细胞为14.53%±0.96%（n=4，p<0.0001），实现约3倍富集；考虑到CD166仅标记约60%的L/M视锥前体，实际富集效率约5倍。
轴突动态性功能验证中，CD166 MACS分选的CRX:tdTomato⁺光感受器前体细胞表现出显著高于未分选细胞的轴突动态性（p<0.0001，每组≥100个轴突末端）和轴突长度（p<0.01，每组>80个轴突末端）。免疫荧光强度分析进一步显示，D50 L/M视锥前体轴突末端同时高表达CD166和tdTomato，而D100末端两者的荧光强度显著降低（p<0.0001），F-actin对照无显著差异，提示CD166可能不仅是被动表面标志，更可能直接参与视锥轴突生长过程。
结论与意义
本研究建立了首个L/M视锥特异性人多能干细胞报告细胞系（L/M-CRR），同时实现了L/M视锥与视杆细胞的独立可视化标记。该系统的创新之处在于将报告基因精确嵌入内源THRB2翻译起始位点，既规避了THRB亚型交叉反应问题，又保持了内源基因表达水平。更重要的是，研究首次证明CD166/ALCAM可作为一种细胞表面功能性标志，用于从任何hPSC来源的视网膜类器官中富集具有高轴突动力学特性的早期L/M视锥感受器前体细胞。
在应用层面，该策略显著缩短了供体细胞制备时间，为治疗年龄相关性黄斑变性等中心凹退行性疾病提供了可放大的细胞纯化途径。在基础研究层面，cluster 2中大量尚未在视网膜发育中报道过的转录因子和信号分子为解析人类L/M视锥命运决定机制提供了新线索。此外，D100视杆前体特有的基因簇同样为视网膜色素变性等视杆退行性疾病的细胞治疗研究提供了参考。
研究亮点
第一，这是首个特异性标记L/M视锥谱系的人多能干细胞报告系统，解决了该领域长期缺乏亚型特异性工具的问题。第二，通过深度分子分型揭示了早期与晚期L/M视锥前体间“迁移-轴突导向”向“视觉感知”程序的时间性转换，机制上解释了轴突生成能力随分化进程丧失的现象。第三，发现并验证了CD166/ALCAM作为功能性表面标志物的富集价值，其空间分布偏好（基底侧聚集）与已知光感受器前体经基底-顶端迁移的过程相一致，提示该分子标志与细胞迁移状态直接相关。第四，双报告体系（tdTomato+EGFP）避免了免疫染色依赖，为活细胞分选与移植研究提供了便利。该研究在方法学严谨性和转化潜力两方面均具有突出价值。