本研究的主要作者包括木春兰（Chunlan Mu）、李晓勇（Xiaoyong Li，为共同通讯作者）、杨佳梅（Jiamei Yang）、田耕耕（Geng G. Tian）、白鹤鹏（Hepeng Bai）、林文慧（Wenhui Lin，通讯作者）、王林辉（Linhui Wang，通讯作者）和吴际（Ji Wu，通讯作者）。作者单位涉及宁夏医科大学基础医学院/教育部生育力保持重点实验室、上海交通大学生物医学工程学院（Bio-X研究院）教育部发育与精神疾病遗传学重点实验室、宁夏医科大学药学院、上海交通大学农业与生物学院、上海交通大学生命科学技术学院/代谢与发育科学国际合作联合实验室，以及第二军医大学（海军军医大学）长海医院泌尿外科/上海市细胞工程重点实验室。该研究以题为“Spatial Transcriptome and Single Nucleus Transcriptome Sequencing Reveals Tetrahydroxy Stilbene Glucoside Promotes Ovarian Organoids Development Through the VEGFA-EPHB2 Pair”的研究论文形式，发表在国际知名学术期刊《Advanced Science》上，并于2024年12月4日在线发表。
本研究的学术背景主要围绕女性生殖健康与卵巢功能障碍。不孕症是全球性的重大健康问题，约17%的全球人口受到影响。在导致女性不孕的多种风险因素中，卵巢功能障碍是导致卵子发生失败的主要驱动因素之一，例如约1%的40岁以下女性经历原发性卵巢功能不全。然而，目前针对卵巢功能障碍的有效治疗方法仍然缺乏。因此，理解和改善卵巢功能成为防治相关不孕症的重要切入点。近年来，类器官技术为在体外研究卵巢发育提供了强大的模型。研究团队先前已利用雌性生殖干细胞成功构建了具备卵子发生和类固醇生成等关键功能的卵巢类器官。另一方面，已有研究报道，从植物中提取的某些化合物可能具有促进卵巢发育的潜力，提示植物源化合物在治疗卵巢功能障碍方面具有前景。然而，以往评估这些化合物效果的研究多采用过于简化的细胞系或过于复杂的动物模型，可能无法准确反映其对卵巢发育的真实影响。相比之下，结构功能类似于真实卵巢的卵巢类器官，为筛选促进卵巢发育的化合物提供了一个更理想的平台。
本研究的主要目标是：首先，建立一个基于无饲养层雌性生殖干细胞的卵巢类器官模型，以排除饲养层细胞的干扰；其次，利用此模型从一系列候选植物源化合物中筛选出能够有效促进卵巢类器官发育的化合物；第三，综合利用空间转录组测序和单细胞核转录组测序等高通量技术，构建卵巢类器官在目标化合物作用下的时空图谱，系统解析其促进发育的细胞和分子机制；最终，阐明特定植物源化合物调控卵巢类器官发育的关键通路，为临床应用提供理论基础和技术平台。
详细的工作流程与研究结果可系统阐述如下：
研究的第一步是建立无饲养层雌性生殖干细胞的长效培养体系并构建卵巢类器官。为了确保卵巢类器官的精确发育不受饲养层细胞的干扰，研究人员首先建立了小鼠无饲养层雌性生殖干细胞的长期培养体系。他们从出生后3-5天的ICR小鼠卵巢中分离和纯化FGSCs，最初在鼠胚胎成纤维细胞饲养层上进行培养和扩增。经过3-4代传代后，FGSCs增殖能力增强。随后，研究人员将FGSCs转移到Matrigel包被的培养板上进行无饲养层培养。结果显示，无饲养层FGSCs的形态与在饲养层上相似，并可传代超过30次。通过RT-PCR和免疫荧光染色证实，这些细胞持续表达DAZL、MVH、Fragilis、Oct4和Stella等生殖细胞标志物，成功建立了无饲养层FGSCs的长期培养系统。接下来，利用这些无饲养层FGSCs与来自胎鼠的女性性腺体细胞（按约1:100的比例）在低吸附U型底96孔板中进行三维共聚集培养3天，形成初始聚集体。然后将这些聚集体转移到Transwell膜上，使用特定的分化培养基继续培养2-3周。生成的卵巢类器官在培养2-3周后，呈现出含有不同发育阶段（包括原始/初级、次级，甚至少量窦前样）卵泡样结构，而仅由体细胞组成的对照组则无此结构。通过构建携带GFP报告基因的FGSCs，研究人员进一步证实了类器官中的卵母细胞来源于FGSCs（GFP阳性），并表达生殖细胞标志物MVH。颗粒细胞表达FOXL2，层粘连蛋白染色显示卵泡基底膜完整。此外，通过对培养上清液的酶联免疫吸附测定（ELISA）分析发现，类固醇激素（抗苗勒管激素AMH、雌二醇E2和孕酮P4）的分泌量随着培养时间延长而持续增加或保持稳定后上升。这些结果共同证明了利用无饲养层FGSCs成功构建了功能性的卵巢类器官模型。
第二步是利用新建的卵巢类器官模型筛选促进发育的植物源化合物。研究人员选取了10种文献报道可能有益于生殖的植物源化合物：二苯乙烯苷（Tetrahydroxy stilbene glucoside, TSG）、羌活酚（Notopterol）、葛根素（Puerarin）、芹菜素（Apigenin）、姜黄素（Curcumin）、原花青素（Procyanidine）、人参皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1）、根皮素（Phloretin）、益母草碱（Leonurine）和赤霉素（Gibberellins）。在类器官培养的前3天，分别用不同浓度的这些化合物进行处理。通过检测减数分裂标志物SYCP3的表达水平进行初筛，发现TSG、羌活酚和葛根素处理组的SYCP3表达显著上调。随后，对这3种化合物进行为期2-3周的长期处理评估。形态学和组织学（苏木精染色）分析表明，TSG处理组中出现更多的次级卵泡样结构，甚至观察到少量窦前卵泡，其促进效果最为显著。RT-qPCR显示，TSG处理组中卵母细胞标志基因（GDF9, ZP3）的表达水平也最高。ELISA检测类固醇激素发现，TSG处理诱导了更高水平的AMH、P4和E2分泌。综合各项指标，TSG在促进卵巢类器官发育方面表现出最显著的效果，因此被选为后续机制研究的对象。
第三步是整合空间转录组测序和单细胞核转录组测序技术，全面解析TSG处理下卵巢类器官的时空转录图谱。这是本研究的核心方法学部分。研究人员分别对TSG处理组和对照组的卵巢类器官进行了ST-seq和snRNA-seq。经过严格的质量控制，最终从对照组获得了8241个高质量细胞核的数据，从TSG处理组获得了6961个。通过整合分析，首先注释了卵巢类器官中的主要细胞类型。基于已知的细胞类型特异性标志基因，共鉴定出7种主要细胞类型：卵母细胞（Oocytes，110个）、颗粒细胞（Granulosa cells, GCs，9418个）、膜细胞（Theca cells，1244个）、免疫细胞（42个）、内皮细胞（192个）、上皮细胞（1005个）和成纤维细胞（3191个）。利用基于深度学习的方法，将snRNA-seq鉴定的细胞类型映射到ST-seq的空间位置上，可视化了这些细胞在类器官组织中的分布。通过差异基因表达分析、基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析发现，在TSG处理组中，卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞的差异上调基因均显著富集于与生殖相关的生物学过程，例如生殖系统发育、卵泡发育、雌配子生成、卵子发生、内分泌激素分泌等。值得注意的是，TGF-β信号通路在这三种细胞类型中均被上调。细胞周期分析显示，TSG处理组中处于S期和G2/M期的细胞比例增加，提示细胞增殖更为活跃。
为进一步揭示TSG如何调控细胞状态，研究使用PySCENIC算法构建了基因调控网络并分析了转录因子活性。发现在TSG处理的卵母细胞中，如BCL11A、IRF2、HOXD3、JUN、ZFP41等转录因子的活性增强；在颗粒细胞中，THRB、SETBP1、CREB3L2、FOXO1、WT1等的活性增强。这些转录因子可能通过调控下游靶基因（例如PT-PRD、ZFP385B等）来介导TSG的促发育效应。为了解析细胞发育的动态轨迹，研究利用Monocle2进行了伪时序分析。对卵母细胞的分析显示，其发育轨迹存在一个分支点。TSG处理组的细胞更多地富集在轨迹的晚期状态，而对照组则多在早期状态，表明TSG加速了卵母细胞的发育进程。对颗粒细胞，先进行了亚群分析，将其分为早期颗粒细胞（eGCs）、壁颗粒细胞（mGCs）和卵丘颗粒细胞（cGCs）。TSG处理组中，处于更分化状态的mGCs和cGCs的比例显著高于对照组。伪时序分析也证实，TSG处理使颗粒细胞整体向发育轨迹的晚期阶段推移。对膜细胞的分析同样观察到了TSG促进其发育的相关基因表达变化。这些多层次的分析共同指向一个结论：TSG通过加速卵巢类器官中多种关键细胞类型（尤其是卵母细胞和颗粒细胞）的发育进程，从而促进整体类器官的成熟。
第四步是聚焦于细胞间通讯，鉴定TSG促进卵巢类器官发育的关键配体-受体对。基于snRNA-seq和ST-seq数据，利用CellPhoneDB数据库系统地分析了卵巢类器官内部，特别是颗粒细胞与卵母细胞之间的配体-受体相互作用。分析发现，在TSG处理组中，有几对涉及颗粒细胞来源的配体与卵母细胞表面受体的相互作用显著增强，其中血管内皮生长因子A（VEGFA）与其受体Ephrin受体B2（EPHB2）的配对（VEGFA-EPHB2 pair）显示出最高的相互作用评分和显著差异。其他如MDK-ALK、ANGPT2-TEK等配对也有增强。反向的、由卵母细胞到颗粒细胞的信号（如GDF9-BMPR2/TGFBR2）也被检测到。研究人员将VEGFA和EPHB2的表达映射到空间转录组切片上，发现TSG处理组中该配受体对的共表达区域增加，提示其空间相互作用更强。实验验证表明：RT-qPCR和Western Blotting证实TSG处理上调了卵巢类器官中VEGFA和EPHB2的mRNA和蛋白表达水平；ELISA检测发现，TSG处理的卵巢类器官培养上清液中，以及用TSG处理的原代颗粒细胞培养上清液中，VEGFA的分泌量均显著增加。免疫荧光染色定位显示VEGFA和EPHB2均定位于卵母细胞膜上。
为探究EPHB2的功能，研究构建了EPHB2敲低（EPHB2-KD）的无饲养层FGSCs。当用这些EPHB2-KD的FGSCs构建卵巢类器官时，产生了发育不良的卵泡样结构，这直接证明了EPHB2对于卵巢类器官的正常发育至关重要。对EPHB2-KD的FGSCs进行批量RNA-seq分析，GO和KEGG富集分析显示，EPHB2缺失影响了类固醇代谢过程、对类固醇激素的反应，以及HIF-1信号通路、MAPK信号通路等与生殖和发育相关的通路。
本研究的结论是：植物源化合物二苯乙烯苷（TSG）能够有效促进基于无饲养层雌性生殖干细胞的卵巢类器官的发育。其作用机制核心在于，TSG增强了颗粒细胞与卵母细胞之间的细胞通讯，特别是通过上调颗粒细胞分泌VEGFA，以及卵母细胞表面受体EPHB2的表达，从而激活VEGFA-EPHB2配体-受体对信号。该信号的增强进一步加速了卵母细胞和颗粒细胞的发育进程，并可能协同其他信号通路（如TGF-β通路），共同推动卵泡生长和类固醇生成，最终实现卵巢类器官结构和功能的成熟。
本研究的科学价值与应用价值主要体现在：首先，在机制层面，首次系统性地绘制了植物源化合物TSG调控卵巢类器官发育的时空转录组图谱，并鉴定出VEGFA-EPHB2这一对以前在卵巢发育中未被充分认识的关键信号轴，深化了对卵巢发育调控网络的理解。其次，在技术层面，建立了将无饲养层卵巢类器官模型与空间/单细胞组学技术相结合的高通量药物筛选与机制研究平台，为研究卵巢生理病理、筛选治疗不孕症及相关疾病的化合物提供了强大的工具。第三，在转化医学层面，明确了TSG促进卵巢发育的潜力，为将其开发为治疗卵巢功能低下等疾病的临床药物或辅助手段奠定了坚实的实验基础，也为其他植物源化合物的生殖药理研究提供了范式。
本研究的亮点包括：1. 模型创新性：成功建立了无饲养层干扰的卵巢类器官模型，提高了实验的精确度和可重复性。2. 技术前沿性：创新性地整合了空间转录组测序（ST-seq）和单细胞核转录组测序（snRNA-seq），不仅解析了细胞异质性，还保留了关键的空间位置信息，实现了对类器官发育的“全景式”解析。3. 机制深度：从细胞类型、亚群、转录因子、发育轨迹到细胞通讯，进行了多层次、系统性的机制挖掘，逻辑链条完整，证据充分。4. 发现新颖性：首次提出并验证了VEGFA-EPHB2信号轴在介导植物源化合物促进卵巢发育中的关键作用，为生殖生物学领域增添了新的知识。5. 应用导向明确：整个研究紧扣“筛选-验证-机制-应用”的主线，具有很强的转化潜力和临床指导意义。
此外，研究也坦诚地指出了其局限性，例如由于技术原因捕获的卵母细胞数量相对较少；对一些关键转录因子的功能预测有待进一步验证；VEGF信号与Eph信号之间是否存在协同效应尚未深入探讨等，这为未来的研究指明了方向。本研究是一项融合了前沿生物技术、发育生物学和药理学的研究，为理解卵巢发育机制和开发新的治疗策略提供了重要见解和实用平台。