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《Vision rescue via unconstrained in vivo prime editing in degenerating neural retinas》

主要作者和机构
该研究的主要作者包括Huan Qin、Wenliang Zhang、Shiyao Zhang、Yuan Feng等，主要研究机构为武汉科技大学视觉神经科学及干细胞工程研究所（Institute of Visual Neuroscience and Stem Cell Engineering, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan, China）。论文通讯作者为Kai Yao。该研究发表于2023年，刊登在《Journal of Experimental Medicine》上。

研究背景

主要科学领域及研究意义
本研究属于基因编辑和视网膜退行性疾病治疗领域，尤其聚焦于视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa，RP）的治疗。RP是一种遗传性视网膜退行性病变，其特征是视网膜感光细胞逐渐丧失，最终导致不可逆的失明。目前，全球RP的患病率约为每4000人中1人。

背景知识与研究目标
随着CRISPR-Cas系统的基因编辑技术在精准基因组修复中的广泛应用，研究者们试图探索其在视网膜退行性疾病治疗中的潜力。然而，传统的基因编辑工具存在一些限制，包括对protospacer adjacent motif（PAM）位点的严格要求以及编辑类型的局限性，特别是在基因突变位点无法满足要求时，基因编辑的有效性大打折扣。
本研究旨在开发一种新的基因编辑工具——结合了prime editors（PE）和一种几乎不受PAM位点约束的SpCas9变体（SpRY）的“PESpRY”系统。此工具旨在突破传统PE的局限性，实现对遗传性RP的目标基因高效修复和视功能恢复。

研究流程与方法

整体研究流程设计
为了验证PESpRY系统的有效性，该研究设计了一系列体外和体内实验流程，分别在工程化细胞系和遗传性RP的pde6brd10鼠模型中进行多步验证。研究共分为以下几步：

1. PESpRY系统的设计与体外验证（第一阶段）

• 实验对象：工程化mouse neuro2a细胞系（Neuro2aRD10），携带与pde6brd10鼠模型中相同的由C→T的pde6b突变基因。
  
• 实验内容：
  
  • 构建PESpRY系统，其核心包含融合Murine Leukemia Virus（M-MLV）逆转录酶的SpRY型Prime Editor。
  • 设计多组prime editing guide RNAs（pegRNAs）（p1至p14），并调整其primer binding site（PBS）长度（13至14 bp）和reverse transcription（RT）模板长度（12至15 bp）。
  • 系统测试PAM序列（如TGC、GTG、CAG）与目标基因位点的兼容性及其编辑效率。
• 实验分析：通过深度测序检测不同pegRNA组合对目标位点（C→T修复）的编辑效率与插入-缺失率（indels）。

2. PESpRY系统在pde6brd10小鼠视网膜中的体内应用（第二阶段）

• 实验对象：pde6brd10小鼠模型，该模型在pde6b基因第13外显子上自然存在C→T突变，导致感光细胞功能障碍（R560C）。
  
• 实验步骤：
  
  1. 病毒载体设计与注射：利用split NPU intein-based dual-AAV系统进行PESpRY系统的递送，分别将目标PESpRY工具和pegRNA注射到小鼠P14的视网膜下隙，以保证工具在感光细胞退化开始之前被递送。对照组注射非特异性scrambled pegRNA。
     
  2. 评价基因编辑效率与PDE6β酶的表达恢复：
     
     • 在P35和P120时间点，通过荧光相关性手段（GFP信号）及深度测序，对目标编辑频率（如PDE6β蛋白恢复情况）和脱靶效应进行定量分析。
       
     • 检测PDE6相关酶活性并评估视细胞生存情况。通过免疫组织化学和厚度量化观察外核层（ONL）保留情况。
       
  3. 视功能改善与行为学验证：
     
     • 使用ERG检测对光刺激的视网膜反应。
       
     • 通过一系列行为学测试（如光-暗箱、视觉导向水迷宫）和光运动反射（OMR）测试，详细评估小鼠的视觉能力。

研究结果与主发现

1. PESpRY系统体外高效的基因编辑能力
- 在Neuro2aRD10细胞中，PESpRY系统与非传统的PAM序列（如GTG、TGC等）在多位点展现了显著的编辑能力，最高编辑效率为63.76%（pegRNA-p5与PAM-GTG组合）。
- 比较显示，传统PE-SpCas9受限于NGG PAM，未能有效编辑目标位点。

2. PESpRY系统在pde6brd10小鼠中的基因修复表现
- 基因编辑效率：在PESpRY和目标pegRNA（gpde6b）注射的P120视网膜中，编辑频率达40.86%-69.92%，indels比例低于0.2%。对照组未检测到有效编辑。
- 蛋白恢复：pde6b基因修复后，PDE6β蛋白水平均恢复至野生型小鼠约75%的水平，cgmp水平均显著下降，表明光受体细胞功能被恢复。

3. 行为学与视功能测试结果
- ERG检测显示，修复组小鼠在不同光刺激条件下均表现出显著的a波和b波反应（如b波幅值达369.8 μV），而对照组无响应。
- 光-暗箱实验表明修复组小鼠明显偏向黑暗，表明其视觉能力显著改善。
- 水迷宫任务中，修复组小鼠能够通过空间频率高达0.4 cycles/°的测试，与野生型小鼠表现接近，而对照组完全失败。

4. PESpRY的定制化与非特异性脱靶效应的评估
- 脱靶分析表明，PESpRY在本研究中的设计显著降低了目标外位点的不良编辑效应。

研究结论和意义

该研究通过开发和应用PESpRY系统，首次实现了对pde6brd10遗传性RP模型视网膜的有效基因修复，显著延长了感光细胞的存活并恢复了视觉功能。这为遗传性眼病的基因编辑治疗提供了重要指导，特别对于那些突变位点受PAM限制的遗传性疾病，PESpRY系统表现出巨大的潜力。

研究亮点

1. 引入了一种近乎不受PAM限制的Prime Editor系统（PESpRY），显著扩展了基因组编辑的靶位点范围。
   
2. 系统验证了PESpRY在体内对神经退行性视网膜疾病修复的有效性。
   
3. 研究设计包括详细行为学功能评估，提供了更全面的视觉功能恢复的证据。

研究价值

PESpRY系统的成功应用不仅为RP基因治疗提供开创性方案，还对未来其他遗传性神经退行性疾病采用精准基因编辑策略提供了技术储备。