本研究由Ashley L. Cooney、Christian M. Brommel、Soumba Traore、Gregory A. Newby、David R. Liu、Paul B. McCray Jr. 和Patrick L. Sinn等作者共同完成，研究团队分别来自美国爱荷华大学、哈佛大学、麻省理工学院等机构。该研究于2023年11月22日发表在《Frontiers in Genome Editing》期刊上，题为“Reciprocal Mutations of Lung-Tropic AAV Capsids Lead to Improved Transduction Properties”。

研究背景

囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）是一种由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变引起的遗传性疾病。腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）载体因其低免疫原性和高安全性，被广泛用于基因治疗研究。然而，AAV载体在肺部的转导效率有限，尤其是在囊性纤维化患者的呼吸道细胞中。为了提高AAV载体在呼吸道细胞中的转导效率，研究人员通过定向进化和衣壳重组技术开发了多种AAV衣壳变体，如AAV2.5T和AAV6.2。这些变体在呼吸道上皮细胞中的转导效率显著提高，但其对不同细胞类型的特异性转导能力尚未得到充分研究。

本研究的目的是通过引入互惠突变（reciprocal mutations）来进一步优化AAV衣壳，以提高其在呼吸道表面细胞和基底细胞中的转导效率，从而为囊性纤维化的基因治疗提供更有效的工具。

研究流程

研究分为多个步骤，主要包括AAV衣壳的设计与合成、呼吸道上皮细胞和基底细胞的培养与转导、荧光显微镜和流式细胞术分析、高通量测序（High-Throughput Sequencing, HTS）以及数据分析。

1. AAV衣壳设计与合成
   研究人员通过计算机模拟设计了多种AAV衣壳变体，包括AAV2.5T、AAV6.2及其突变体（如AAV2.5TFF、AAV6.2FF等）。这些衣壳变体通过基因合成技术生成，并由爱荷华大学的病毒载体核心实验室进行生产和滴定。

2. 呼吸道上皮细胞和基底细胞的培养与转导
   研究人员使用来自人类供体的呼吸道上皮细胞（Human Airway Epithelial, HAE）和基底细胞进行实验。HAE细胞在气液界面（Air-Liquid Interface, ALI）条件下培养，形成分化良好的上皮细胞层。基底细胞则直接分离自人类肺组织，并在胶原包被的培养板上进行培养。细胞在转导前使用蛋白酶体抑制剂（如多柔比星和LLNL）预处理，以提高AAV载体的转导效率。

3. 荧光显微镜和流式细胞术分析
   转导后，研究人员使用荧光显微镜观察GFP和mCherry的表达情况，并通过流式细胞术定量分析转导效率。结果显示，AAV2.5T在呼吸道表面细胞中的转导效率优于AAV6.2，而AAV6.2在基底细胞中的转导效率更高。

4. 高通量测序
   为了评估腺嘌呤碱基编辑器（Adenine Base Editor, ABE）的编辑效率，研究人员使用高通量测序技术对CFTR基因的R553X突变位点进行分析。结果显示，AAV6.2载体在HAE细胞中的编辑效率显著高于AAV2.5T。

主要结果

1. AAV衣壳变体的转导效率
   研究发现，AAV2.5TFF和AAV6.2FF变体在呼吸道上皮细胞中的转导效率显著提高。特别是AAV2.5TFF+L变体在表面细胞中的转导效率最高，而AAV6.2FF在基底细胞中的转导效率最佳。

2. 细胞类型特异性转导
   通过流式细胞术分析，研究人员发现AAV2.5T和AAV6.2对不同细胞类型的转导偏好性不同。AAV2.5T更倾向于转导表面细胞，而AAV6.2则更倾向于转导基底细胞。

3. 蛋白酶体抑制剂的作用
   尽管引入了Y→F突变以减少蛋白酶体降解，但研究发现这些突变体仍需要蛋白酶体抑制剂来提高转导效率。然而，AAV2.5TFF和AAV6.2FF变体在较低浓度的多柔比星下表现出更高的转导效率。

4. 腺嘌呤碱基编辑器的应用
   研究人员使用AAV载体将腺嘌呤碱基编辑器（ABE）递送至HAE细胞，成功修复了CFTR基因的R553X突变。AAV6.2载体的编辑效率达到35%，显著高于AAV2.5T的14%。

结论

本研究通过引入互惠突变优化了AAV衣壳的转导特性，显著提高了其在呼吸道表面细胞和基底细胞中的转导效率。这些优化后的AAV载体不仅为囊性纤维化的基因治疗提供了新的工具，还为其他肺部疾病的基因治疗研究奠定了基础。特别是AAV6.2FF和AAV2.5TFF+L变体在转导效率和细胞类型特异性方面的表现，为未来的临床应用提供了重要参考。

研究亮点

1. 创新性衣壳设计：通过引入互惠突变，研究人员成功开发了具有更高转导效率的AAV衣壳变体。
2. 细胞类型特异性转导：研究揭示了AAV2.5T和AAV6.2在不同细胞类型中的转导偏好性，为精准基因治疗提供了依据。
3. 腺嘌呤碱基编辑器的成功应用：研究首次使用AAV载体将腺嘌呤碱基编辑器递送至呼吸道细胞，成功修复了CFTR基因的突变。

研究意义

本研究不仅为囊性纤维化的基因治疗提供了新的工具，还为其他肺部疾病的基因治疗研究开辟了新的方向。通过优化AAV载体的转导特性，研究人员为未来的临床转化奠定了基础。此外，研究中使用的高通量测序技术和腺嘌呤碱基编辑器也为基因编辑领域提供了新的思路和方法。