该文档属于类型a，是一篇关于微胶质细胞中YY1乳酰化促进视网膜新生血管形成的原创性研究论文。以下是基于要求生成的学术报告：
《Genome Biology》2023年刊载：微胶质细胞中YY1乳酰化通过转录激活上调FGF2促进视网膜血管新生的机制研究
1. 研究团队与发表信息
本研究由多机构团队合作完成，通讯作者为Shengping Hou（重庆医科大学附属第一医院、重庆眼科学重点实验室）。第一作者Xiaotang Wang和Wei Fan贡献同等。合作单位包括南京医科大学附属眼科医院、北京同仁医院等。论文于2023年发表在《Genome Biology》期刊（DOI: 10.1186/s13059-023-02931-y），遵循Creative Commons Attribution 4.0国际许可协议开放获取。
2. 学术背景
科学领域：研究聚焦于缺氧诱导的视网膜病变（如早产儿视网膜病变ROP）中新生血管形成的表观遗传调控机制，涉及神经免疫代谢交互（immunometabolism）与蛋白质翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）领域。
研究动机：尽管抗VEGF疗法广泛应用于视网膜新生血管疾病，但部分患者存在耐药性，这可能是由于多重促血管因子参与其中。微胶质细胞作为视网膜常驻免疫细胞，在缺氧环境下被激活并促进血管生成，但其分子机制尚不明确。乳酸衍生的新型翻译后修饰——乳酰化（lactylation）在多种细胞过程中起关键作用，但其在血管生成中的功能未被阐明。本研究旨在探究乳酰化是否通过调控微胶质细胞功能参与视网膜新生血管形成。
关键背景知识：
- 乳酰化：由Zhang等（2019）首次报道的组蛋白修饰，由乳酸通过p300介导的酰基转移作用形成，调控基因转录。
- YY1（Yin Yang-1）：多功能转录因子，可通过结合DNA启动子激活或抑制靶基因（如FGF2）。
- 视网膜缺氧模型（氧诱导视网膜病变OIR）：模拟ROP的经典动物模型，以病理性血管增生为特征。
研究目标：
1. 验证微胶质细胞乳酰化在OIR中的作用；
2. 鉴定缺氧条件下微胶质乳酰化蛋白质组特征；
3. 揭示YY1乳酰化调控FGF2表达的分子机制；
4. 探索靶向乳酰化通路的治疗潜力。
3. 研究流程与方法
整体设计：研究包含体外（人源微胶质细胞系HMC3）与体内（C57BL/6J小鼠OIR模型）实验，结合临床样本分析，分为以下关键步骤：
步骤1：微胶质细胞在视网膜新生血管中的必要性验证
- 对象：OIR小鼠（P17，n=5/组）与微胶质细胞耗竭组（CSF1R抑制剂PLX3397处理）。
- 方法：通过免疫荧光（CD31/IBa1共染）量化视网膜血管增生与微胶质细胞空间分布；采用细胞计数软件（CellSens）分析微胶质密度。
- 关键技术：PLX3397的剂量优化（1 mg/kg/day，P10-P17腹腔注射），验证其对微胶质的选择性耗竭效果。
步骤2：乳酸与乳酰化水平与血管新生的相关性分析
- 对象：OIR小鼠视网膜组织（P13/P17，n=3）、ROP患儿（n=49）与非ROP早产儿（n=72）血液样本。
- 方法：
- 乳酸含量测定：LA Assay Kit检测视网膜组织及血液乳酸浓度；
- 全蛋白乳酰化（pan-Kla）水平：Western blot与免疫荧光（pan-Kla抗体）；
- 药物干预：乳酸调节剂DCA（抑制乳酸生成）和鱼藤酮（促进糖酵解）处理OIR小鼠。
- 关键发现：OIR小鼠视网膜乳酸与pan-Kla水平显著升高，且与微胶质细胞激活共定位；ROP患儿血乳酸水平高于非ROP组。
步骤3：缺氧诱导的微胶质乳酰化蛋白质组学分析
- 对象：常氧 vs. 低氧（1% O2，24h）处理的HMC3细胞。
- 方法：基于4D标记自由平台的乳酰化修饰组学（lactylome），联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。
- 数据质量控制：定位概率>0.75，假阳性率（FDR）<1%； - **差异乳酰化蛋白筛选**：Hypoxia vs. Normoxia组间fold change>2。
- 结果：鉴定出67个乳酰化上调蛋白（如YY1）和162个下调蛋白，其中YY1在K183位点乳酰化修饰水平升高3.56倍。
步骤4：YY1乳酰化的功能验证与机制研究
- 对象：YY1野生型（WT）与K183R突变体（模拟去乳酰化）转染的HMC3细胞。
- 关键实验：
- 结合实验：染色质免疫共沉淀（ChIP-qPCR）验证YY1与FGF2启动子结合（-1336至-1172 bp区域）；
- 功能实验：共培养体系（HMC3与HRMECs）中，检测血管生成指标（管形成、球体出芽、迁移/增殖）。
- 调控机制：p300（Kla写入酶）抑制剂A485处理，证实其通过抑制YY1乳酰化降低FGF2表达。
步骤5：体内治疗潜力评估
- 对象：OIR小鼠玻璃体内注射A485（200 μM，P14）。
- 方法：视网膜铺片（CD31染色）量化新生血管面积；Western blot检测YY1-K183la与FGF2水平。
4. 主要研究结果
1. 微胶质细胞是视网膜新生血管的必要条件：PLX3397耗竭微胶质后，OIR小鼠血管增生减少52%（p<0.01），证实其促血管作用。
2. 乳酸-乳酰化轴驱动血管生成：
- 低氧条件下，HMC3细胞乳酸产量增加2.8倍，乳酰化修饰（55-70 kDa蛋白）显著增强；
- 鱼藤酮（促乳酸）加重血管增生，而DCA（抑乳酸）缓解病变。
3. YY1 K183乳酰化激活FGF2转录：
- 乳酰化组学发现YY1为关键靶点，质谱确认K183修饰位点；
- YY1-K183R突变体转染导致FGF2表达下降60%（p<0.001），血管生成能力减弱；
- ChIP-qPCR显示缺氧下YY1与FGF2启动子结合增加4倍（p<0.01），而K183R突变削弱此效应。
4. p300/Yy1乳酰化轴的靶向干预：
- A485抑制p300后，YY1乳酰化水平降低70%，视网膜新生血管面积减少45%（p<0.001）。
5. 研究结论与价值
- 科学意义：首次阐明非组蛋白（YY1）乳酰化通过表观遗传调控FGF2表达促进血管生成的机制，拓展了乳酸功能的认识。
- 应用价值：提出靶向p300/YY1乳酰化通路的新策略，为抗VEGF耐药性视网膜病变提供替代治疗方案。
6. 研究亮点
- 技术创新：首次将4D乳酰化修饰组学应用于微胶质细胞研究，鉴定出YY1等非组蛋白靶点。
- 理论突破：揭示YY1乳酰化通过解除其抑制域活性转化为转录激活因子的分子开关机制。
- 临床转化潜力：A485在OIR模型中的显著疗效支持其作为候选药物进一步开发。
7. 其他要点
- 局限性：尚未构建YY1-K183R敲入小鼠模型，体内功能需进一步验证；ROP患儿乳酰化水平与微胶质活性的直接证据待完善。
- 未来方向：探索乳酰化在生理性血管发育（如出生后视网膜血管网络形成）中的作用。
该报告系统整合了实验设计、数据链条与机制解析，为视网膜血管病变研究提供了新的理论框架与干预靶点。