主要作者及发表信息
该研究由来自宾夕法尼亚大学（University of Pennsylvania）的孙春晓（Chunxiao Sun）和聂秋月（Qiuyue Nie）作为共同第一作者，沈亦辉（Yihui Shen）和高雪（Xue Gao）作为共同通讯作者完成。研究于2026年在线发表在《自然·生物技术》（nature biotechnology）期刊上。
学术背景
丝状真菌（filamentous fungi）是生态系统中的重要组成部分，驱动着养分循环和土壤形成，同时作为工业宿主，拥有巨大的生物合成（biosynthetic）潜力。然而，其基因组中超过90%的生物合成基因簇（BGCs）仍未被鉴定，部分原因在于丝状真菌是遗传操作最困难的真核生物之一。传统的CRISPR-Cas9技术依赖于产生DNA双链断裂（DSBs），可引发不可控的插入和缺失，而胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器（base editors）虽能避免DSBs，但其编辑范围仅限于转换突变（transition mutations），无法实现颠换（transversions）、插入或缺失。
先导编辑（prime editing, PE）技术通过在Cas9切口酶（nickase）上融合逆转录酶（reverse transcriptase），并使用先导编辑向导RNA（pegRNA）来编码目标编辑，能够在不依赖DNA双链断裂或供体DNA模板的情况下实现所有碱基替换及精确的插入和缺失。然而，PE在丝状真菌中的建立面临挑战，其效率常因pegRNA的复杂优化而受限，且真菌与哺乳动物系统的错配修复（mismatch repair, MMR）机制存在显著差异。因此，建立一个适合丝状真菌的高效PE平台，对于系统性地发掘其生物合成潜力至关重要。
研究的详细工作流程
该研究旨在开发并优化一套适用于丝状真菌的高效先导编辑系统，并将其应用于调控因子的操纵以激活沉默的代谢途径。整个研究主要分为三个关键步骤：
第一步：构建与优化真菌先导编辑系统（fpe7max）
研究者首先将模型菌株构巢曲霉（*Aspergillus nidulans*）LO8030作为初始宿主，筛选了包括PE2、PE3、PE4、PE5、PEmax、PE6c和PE6d在内的多种PE架构。通过靶向*p*基因（*wa0*位点）并引入提前终止密码子（+8 C to T），结果显示PEmax的编辑效率最高（通过NGS定量为27.7%）。为提升效率，他们优化了PE效应蛋白和pegRNA的表达：通过筛选五个强组成型启动子，发现使用*pgpda*启动子可将效率提升至55.0%；在pegRNA表达方面，通过比较多种启动子，发现5S rRNA–tRNA混合启动子结合PEmax能将编辑效率提升至82.0%，且脱靶插入缺失（indels）率仅为1.58%。
针对大片段编辑效率低下的问题，研究团队观察到PEmax在1 kb缺失和100 bp插入上的性能显著下降。他们发现，通过短发夹RNA（shRNA）沉默错配修复（MMR）通路中的关键基因*mlh1*和*pms*，或直接使用融合了显性负性MutL同源物1（MLH1dn）的PEmax架构来抑制MMR，均能显著提高编辑效率。更重要的是，为了稳定pegRNA，研究者从构巢曲霉中鉴定了一个与人源La蛋白有38%序列同一性的真菌La样蛋白（fla）。将人源La蛋白替换为fla，并整合MLH1dn，最终研制出一个名为fpe7max的真菌特异性先导编辑器。定量分析表明，fpe7max能将1 kb缺失和100 bp插入的效率分别提高8.2倍和7.6倍。
第二步：系统性地评估fpe7max的性能
研究者对fpe7max系统进行了全面评估，使用了构巢曲霉及多种其他丝状真菌作为研究对象。在构巢曲霉的*wa*基因的10个不同位点上，fpe7max在碱基替换、插入和缺失方面的平均编辑效率分别达到91.0%、88.9%和90.1%，显著优于PEmax。在10个功能多样的内源性位点（包括生物合成基因和转录调控基因）上，其单碱基替换效率高达86.1%至95.8%，平均indels率低至1.62%。此外，fpe7max表现出高特异性，在评估的17个潜在脱靶位点上，平均脱靶编辑频率仅为0.0430%。研究还证明，fpe7max能在非NHEJ缺陷型菌株中高效工作，不依赖于同源重组修复途径。通过tRNA阵列实现的多重编辑实验表明，fpe7max可以同时对三个位点（单碱基替换、100 bp插入和1 kb缺失）进行高效编辑，且效率不受影响。
研究的跨物种兼容性评估涵盖了曲霉科（如*Penicillium citrinum*、*Aspergillus niger*）及更远缘的木霉属（Trichoderma spp.）和毛壳菌属（*Chaetomium globosum*）物种。在曲霉科物种中，fpe7max的平均编辑效率高达85.4%；通过使用物种特异性的启动子优化pegRNA表达后，在系统发育距离更远的真菌中也实现了52.8%至71.1%的编辑效率。这些结果确立了fpe7max作为一款高效、通用、多功能的丝状真菌基因组编辑平台。
第三步：应用fpe7max编辑uORF以调控全局代谢
研究团队选择了一种创新的策略来激活真菌沉默代谢途径：精确编辑全局转录调控因子*LaeA*的上游开放阅读框（upstream open reading frame, uORF）。uORFs通常抑制下游主要开放阅读框（pORF）的翻译。理论上，通过破坏uORF可以解除对*LaeA*的翻译抑制，从而温和地上调其蛋白质水平，进而全局性地扰动并激活次级代谢。
作为概念验证，研究者在黑曲霉（*A. niger*）NRRL326中，使用fpe7max精确删除了*laeA*的63-bp uORF。蛋白质印迹（western blotting）证实了LaeA蛋白丰度增加，而mRNA水平保持不变。比较代谢组学分析显示，uORF缺失菌株的代谢谱发生了剧烈变化，大量LC-MS信号上调。全球天然产物社会分子网络（GNPS）分析揭示了一个不含已知化合物的大型分子网络簇（Cluster 5），表明存在全新的代谢物。
该策略的普适性在多个物种中得到了验证。在温特曲霉（*A. wentii*）和利氏曲霉（*A. leporis*）中，fpe7max被用于删除*LaeA*基因上复杂的、重叠的多个uORFs。在所有突变体中，代谢组学分析均显示出明显的代谢重塑，并激活了在野生型中未检测到的分子网络簇。在更远的物种如绿色木霉（*T. atroviride*）等中，uORF缺失同样导致了显著的代谢改变，证明了该策略在不同系统发育背景中的广泛适用性。
研究的主要结果
通过放大发酵和结构鉴定，研究人员从uORF编辑菌株中共分离并鉴定了18个代谢物。其中，从黑曲霉uORF缺失株中获得了6个主要的吡喃尼格林（pyranonigrin）类衍生物（化合物1–6），包括4个新颖结构。特别是化合物4–6，代表首次发现的苯丙氨酸衍生物单位与吡喃尼格林骨架的杂合体。qPCR分析证实其核心生物合成基因*pyna*的表达上调了12.5至32.6倍。从温特曲霉中鉴定出8个化合物（7–14），包括一个新的含半胱氨酸的阿斯普温汀（aspewentin S），其通过独特的C-S键连接。从利氏曲霉中发现了4个色酮（chromone）衍生物（15–18），其中化合物15为新的penithochromone Z。初步的生物活性测试显示，新化合物4和5对Jurkat白血病细胞表现出细胞毒性（IC50约为6.6–6.7 μM），而化合物7则对多种癌细胞系具有广谱细胞毒性。
研究结论与价值
该研究成功开发了fpe7max——一种为丝状真菌量身定制的先导编辑平台。该平台不仅能够以接近90%的平均效率实施所有类型的碱基替换、插入和缺失，更能高效实现长达1 kb的插入和10 kb的缺失，远超现有技术。通过fpe7max精确编辑*LaeA*的uORF，研究团队在多种真菌中实现了全局代谢调控，并从中发现了18个代谢物，包括8个新结构，其中3个具有细胞毒性。
这项工作的科学价值在于打破了丝状真菌精准基因组工程的技术壁垒，为系统性研究真菌生物学、尤其是为激活和挖掘其巨大的隐性化学宝库提供了强大的方法论。其应用价值体现在为药物发现、农业和工业生物技术的底盘开发提供了一种可编程、高保真且通用的基因组操作策略。uORF编辑作为一种新颖的通用化策略，通过温和地调节内源性调控网络来接触真菌的化学多样性，在合成生物学和天然产物研究中具有广阔的应用前景。
研究亮点