本研究由Nicole J. Darling、Elias Sideris、Naomi Hamada、S. Thomas Carmichael和Tatiana Segura等人完成，主要作者来自University of California, Los Angeles化学与生物分子工程系及神经病学系，通讯作者Tatiana Segura现任职于Duke University。该研究发表于Advanced Science期刊，2018年10月11日在线发表，论文标题为《Injectable and Spatially Patterned Microporous Annealed Particle (MAP) Hydrogels for Tissue Repair Applications》。

本研究属于组织修复与再生医学领域，具体聚焦于可注射水凝胶材料的设计及其在皮肤伤口和脑卒中组织修复中的应用。细胞外基质（extracellular matrix, ECM）是由复杂蛋白质和糖胺聚糖等生物大分子构成的异质性网络，为组织提供力学支撑和生化信号，调控细胞生长、迁移和分化。损伤发生后，ECM被炎症细胞释放的蛋白酶和机械力破坏，在慢性难愈合伤口中，这种基质降解会限制新生组织沉积所需的物理和化学支持；在脑损伤中，除基质降解外，还会形成不可渗透的星形胶质细胞瘢痕，阻止新基质沉积。为促进组织修复，研究者尝试构建人工ECM支架以模拟天然ECM的某些功能。过去几十年中，含物理和生物活性信号的聚合物水凝胶被开发为ECM模拟物，其中可注射水凝胶因能通过溶胶-凝胶转变在任意伤口或腔体中原位成型而具有很高的临床转化潜力。然而，大多数可注射水凝胶在物理和化学上是均质的，而天然ECM往往具有梯度结构，物理或化学梯度对于将细胞招募至伤口或卒中腔等特定位置十分必要。以往在凝胶中引入梯度多采用光聚合方法，但这种方法制备的水凝胶不能注射，临床应用受限。因此，开发具有明确梯度结构的可注射水凝胶仍是该领域的重要挑战。

作者所在团队此前已开发了第一类可注射的合成多孔水凝胶，称为微孔退火颗粒（microporous annealed particle, MAP）水凝胶。MAP水凝胶是由微米级水凝胶颗粒在注射后相互退火而成的颗粒材料，颗粒间因填充不均匀而含有相互连通的微米级多孔网络。已有研究表明MAP支架能够加速伤口愈合并减少炎症，是理想的人工ECM支架，但此前其构建单元均为均匀混合，形成随机分布结构。本研究的目标是利用堵塞层状颗粒结构实现MAP水凝胶的空间图案化，使其在注射后仍保持层状结构，并在皮肤伤口、皮下植入和脑卒中腔等多种模型中验证该方法的可行性。

研究首先利用流动聚焦微流控装置制备直径约100微米的微凝胶（microgel, µgel）构建单元，并在制备过程中分别用555 nm、488 nm和647 nm三种荧光团标记微凝胶（分别显示为红色、绿色和白色），以便通过荧光共聚焦显微镜观察层状结构。微凝胶还含有凝血因子XIIIa（factor XIIIa, FXIIIa）的两种肽底物，使颗粒可通过酶促转谷氨酰胺反应实现退火。在体外实验中，等体积的绿色、红色和远红（白色）微凝胶依次快速注入聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）模具中，从左到右形成层状结构。ImageJ分析显示，从左到右依次出现绿色像素峰、红色像素峰和白色像素峰，表明微凝胶在注射后保持了各自位置。定量分析显示，各层中大部分微凝胶为对应注射颜色，其中第一层绿色微凝胶占89%，第二层红色微凝胶占80%，第三层远红微凝胶占69%；红色区域因与绿色和白色区域同时接触而含有等量白色和绿色微凝胶，但绿色和白色区域彼此不接触，因此互相混杂很少。这说明通过顺序注射和退火可在体外实现直线型图案，且该策略不限于三层等体积结构。

随后，研究者在体内皮肤伤口模型中测试了图案化水凝胶。利用活检打孔器在小鼠背部制造约6毫米直径、1毫米高的圆柱形全层皮肤伤口，采用由外向内依次注射不同颜色微凝胶的方式形成径向图案：最外层为白色，中间层为红色，最内层为绿色。注射后第3天沿伤口中心切半并用共聚焦显微镜成像，观察到白色微凝胶在两端、绿色微凝胶在中心、红色微凝胶位于两者之间的径向图案。像素强度曲线定量显示两个白色峰位于边缘，一个绿色峰位于中间，两个红色峰位于白色与绿色峰之间。定量分析表明，白色、红色和绿色区域中各自颜色微凝胶的比例分别为88%、62%和69%，中间红色层因与两侧区域接触而混杂程度最高，但仍以红色微凝胶为主（61.72 ± 18.84%）。这些结果证明通过顺序注射MAP微凝胶可在体内获得由不同层组成的径向图案。

针对皮下注射和脑内注射等不易多次顺序注射的情况，研究者提出通过单次注射实现层状结构的策略。将每种颜色微凝胶各15微升依次吸入移液管，总量45微升，再反向装载至注射器中以保持相同顺序。使用可控注射分配器将水凝胶从侧面注入两个盖玻片之间以模拟皮下注射，所得水凝胶经共聚焦成像显示确为径向图案。由于白色微凝胶最先吸入而最后排出，红色微凝胶最后吸入而最先排出，红色微凝胶被绿色微凝胶径向向外推挤，绿色微凝胶再被白色微凝胶向外推挤，形成三层分明的结构，层间混合很少。ImageJ分析显示，白色、绿色和红色微凝胶在各自颜色区域中的比例分别为72%、69%和86%；混合主要发生在相邻层之间，因此白色区域中很少混入红色微凝胶，反之亦然。由于各颜色体积相等但外层表面积不同，各层厚度不相同；若需等厚层，则各层体积应根据其占据的外表面积进行缩放。

为模拟卒中腔注射，研究者使用注射泵以1微升/分钟的连续速率将图案化水凝胶注入同样的双盖玻片模型中。该速率为此前体内研究曾使用的速率。在此条件下，绿色微凝胶最先排出形成外层，红色微凝胶形成中间层，白色微凝胶最后排出形成内层。ImageJ分析表明，较慢的注射速率比体外推注产生更少的混合和更清晰的图案，白色、红色和绿色微凝胶在各自区域中的比例分别提高至83%、80%和91%；中间层红色微凝胶保留在红色区域的比例由69.03%提升至79.55%。这说明降低注射速率可显著改善层状结构，尤其是与内外层均接触的中间层。

上述体外实验取得积极结果后，研究者在体内皮下植入模型中进一步验证。按与体外相同的方法装载注射器，将45微升图案化水凝胶注射到小鼠皮下。第3天收集皮肤组织，经多聚甲醛固定后成像。与体外结果不同，体内皮下注射未观察到明显的径向图案，这可能与注射角度和进入受限空间有关，但仍可观察到清晰的白色、绿色和红色区域。分析显示，白色、绿色和红色微凝胶在各自区域中的比例分别为65%、69%和55%；内层白色区域中的混合微凝胶主要来自相邻的绿色区域，中间绿色区域中混有相当数量的白色和红色微凝胶，外层红色区域中混入的主要为绿色微凝胶，与体外结果相似。这些结果表明，通过单次注射和皮下植入可在体内获得具有三个分区的空间图案化可注射水凝胶。

最后，研究者在小鼠光血栓（photothrombotic, PT）卒中模型中评价了原位图案化。通过光血栓法在小鼠运动皮层诱导缺血形成卒中腔，卒中后第5天以1微升/分钟的速度注射总计6微升图案化水凝胶，并使其退火。两周后收集脑组织并进行冷冻切片，在卒中病灶中部获得最大水凝胶截面进行共聚焦成像。与体内皮下注射不同，卒中腔内观察到径向图案：白色微凝胶位于内层，绿色微凝胶位于中间层，外层红色区域混合程度较高。定量分析显示，白色和绿色微凝胶在各自区域中的比例均为76%，而红色微凝胶在红色区域中的比例仅为54%。绿色与红色微凝胶在绿色区域分离度较低的原因可能是绿色层厚度较薄。尽管如此，白色和绿色区域表现出良好分层，红色区域也实现大部分分离。

本研究的核心结论是：利用MAP水凝胶颗粒构建单元的可调性，可以制备可注射、多孔且具有空间梯度结构的水凝胶。通过顺序注射或单次注射均可建立不同颜色MAP亚单位组成的梯度结构，并在体外、伤口愈合模型、皮下植入模型和卒中腔模型中得到验证。相邻层之间仅出现较低程度的扩散，且通过注射泵控制注射速率可以进一步减少混合。该平台具有广泛的再生医学应用前景，可适应多种器官；由于MAP亚单位高度可调，还可通过改变各层微凝胶的刚度或肽密度、包载不同浓度的生长因子（如血管内皮生长因子VEGF、脑源性神经营养因子BDNF等）来构建刚度梯度或生化梯度，从而引导神经元或角质形成细胞迁移。据作者所知，这是首个具有体内应用潜力的可注射多孔梯度水凝胶。该研究的学术价值在于提出了一种无需后加工即可在可注射多孔水凝胶中实现空间图案化的新策略，解决了现有光聚合图案化水凝胶无法注射的问题；其应用价值在于该材料可用于皮肤伤口修复、皮下植入和脑卒中修复等多种组织修复场景，通过设计不同物理或生化梯度来引导细胞迁移和组织再生。研究亮点包括：首次报道可注射、多孔、梯度水凝胶并验证其体内可行性；证明单次注射即可建立径向多层结构；利用易堵塞的层状颗粒结构实现注射后保持图案；并通过控制注射速率优化层间分离程度。