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基于SARS-CoV-2受体结合域（RBD）和七肽重复序列（HR）的纳米颗粒疫苗研究

作者及发表信息
本研究由中山大学人类病毒学研究所、热带病防控教育部重点实验室等机构的研究团队完成，主要作者包括马先才（Xiancai Ma）、邹帆（Fan Zou）、余飞（Fei Yu）等人，通讯作者为张辉（Hui Zhang）。该研究于2020年11月25日在《Immunity》期刊上发表。

学术背景
自2019年底新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引发的COVID-19疫情爆发以来，全球范围内已有超过5200万确诊病例和100万死亡病例。由于病毒传播性强且缺乏有效的疫苗和治疗药物，开发一种安全、高效的疫苗成为当务之急。SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike protein, S蛋白）是病毒识别和进入宿主细胞的关键分子，其受体结合域（RBD）和七肽重复序列（HR）具有高度免疫原性，是疫苗设计的理想靶点。然而，传统的单体疫苗在抗原密度和免疫原性方面存在不足，难以有效激活宿主免疫系统。因此，本研究旨在通过设计基于RBD和HR的纳米颗粒疫苗，提高疫苗的免疫原性和保护效果。

研究流程
本研究分为多个实验步骤，详细流程如下：

1. 疫苗构建与纯化
   研究团队利用幽门螺杆菌来源的非血红素铁蛋白（H. pylori ferritin）作为纳米颗粒核心，并通过SpyTag/SpyCatcher系统将RBD或HR抗原共价连接到铁蛋白表面。具体步骤包括：

   • 在大肠杆菌中表达并纯化SpyCatcher修饰的铁蛋白（sc-ferritin），在CHO-S细胞中表达并纯化SpyTag修饰的RBD（st-RBD）和HR（st-HR）。
     
   • 将sc-ferritin与st-RBD或st-HR混合，在常规缓冲液中孵育，形成不可逆的异肽键连接。
     
   • 使用尺寸排阻色谱法（SEC）分离并浓缩形成的纳米颗粒。
     

2. 动物模型免疫实验

   • 选取BALB/c小鼠、表达人源化ACE2受体的转基因小鼠（hACE2小鼠）以及恒河猴作为实验对象。
     
   • BALB/c小鼠分为六组，分别接种RBD单体、HR单体、RBD纳米颗粒、HR纳米颗粒、RBD-HR纳米颗粒以及对照组。每组6只小鼠，采用皮下注射方式，剂量为10 μg，间隔4周进行加强免疫。
     
   • hACE2小鼠和恒河猴实验流程类似，分别用于评估疫苗对真实病毒感染的保护效果和非人灵长类动物中的免疫原性。
     

3. 免疫学检测

   • 使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中特异性IgG抗体滴度。
     
   • 使用焦点减少中和试验（FRNT）评估中和抗体（NAb）水平。
     
   • 通过流式细胞术分析脾脏中T细胞和B细胞的免疫反应。
     
   • 利用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测抗原特异性T细胞分泌的细胞因子（如IFN-γ、IL-2、TNF-α）。
     

4. 抗原呈递与交叉反应研究

   • 构建红色荧光蛋白（RFP）标记的RBD单体和RBD-铁蛋白纳米颗粒，追踪抗原在淋巴结中的分布和捕获情况。
     
   • 检测纳米颗粒疫苗是否能够诱导针对其他冠状病毒的交叉中和抗体和T细胞反应。
     

主要结果
1. 纳米颗粒疫苗显著增强体液免疫反应
- 在BALB/c小鼠中，RBD和RBD-HR纳米颗粒疫苗诱导的RBD特异性IgG抗体滴度高于单体疫苗（>10⁵ vs. 10²–10³）。
- HR纳米颗粒疫苗也能够诱导高滴度的HR特异性IgG抗体（>10³）。
- 中和抗体实验显示，RBD和RBD-HR纳米颗粒疫苗诱导的中和抗体滴度比单体疫苗高出10–100倍，且能够在1:100稀释条件下完全中和真实病毒。

1. 纳米颗粒疫苗激活强效的T细胞免疫反应

   • 纳米颗粒疫苗诱导的CD8⁺ T细胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的比例显著高于单体疫苗。
     
   • RBD-HR纳米颗粒疫苗诱导的Th1型免疫反应更强，而未观察到可能引发疫苗相关增强性呼吸道疾病（VAERD）的Th2型免疫反应。
     

2. 交叉保护作用

   • RBD-HR纳米颗粒疫苗诱导的中和抗体能够交叉中和其他冠状病毒（如SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43和RatG13）。
     
   • HR区域包含多种交叉反应性T细胞表位，能够激活针对其他冠状病毒的T细胞免疫反应。
     

3. 保护效果与安全性

   • 在hACE2小鼠中，RBD和RBD-HR纳米颗粒疫苗完全阻止了真实病毒感染，肺部未检测到病毒RNA。
     
   • 在恒河猴中，纳米颗粒疫苗诱导的中和抗体滴度持续至少3个月，且未观察到抗体依赖性增强（ADE）效应或严重副作用。
     

结论与意义
本研究表明，基于RBD和HR的纳米颗粒疫苗具有显著的免疫原性和保护效果，能够有效预防SARS-CoV-2感染，并可能提供针对其他冠状病毒的交叉保护。这些疫苗的设计理念简单高效，易于大规模生产，且安全性良好，为应对当前及未来的冠状病毒威胁提供了重要参考。

研究亮点
1. 创新性设计：首次将RBD和HR抗原共价连接到铁蛋白纳米颗粒上，显著提高了抗原密度和免疫原性。
2. 广谱保护作用：RBD-HR纳米颗粒疫苗不仅能够中和SARS-CoV-2，还对多种其他冠状病毒表现出交叉中和能力。
3. 安全性验证：未观察到ADE效应或严重副作用，表明该疫苗具有较高的安全性。
4. 高效生产工艺：疫苗制备过程无需特殊酶或缓冲液，适合大规模生产。

其他有价值内容
本研究还探讨了HR区域作为通用冠状病毒疫苗候选抗原的潜力，为进一步开发广谱冠状病毒疫苗奠定了基础。此外，研究团队提出了一种简便的抗原追踪方法，为未来纳米颗粒疫苗的研究提供了新思路。