本文发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》（J. Agric. Food Chem.）2024年第72卷，出版于2024年12月12日。主要作者为Weizhu Zeng, Huijing Wang, Jianbin Chen, Minglong Hu, Xinru Wang, Jian Chen和通讯作者Jingwen Zhou*。研究团队来自江南大学，其所属机构包括教育部食品合成生物技术工程研究中心、未来食品科学中心、工业生物技术教育部重点实验室及生物工程学院，以及江苏省食品合成生物技术工程研究中心。本研究隶属于合成生物学与代谢工程领域，重点关注利用微生物细胞工厂进行高价值植物天然产物的从头合成。

此项研究的学术背景聚焦于红景天苷（Salidroside）的生物制造难题。红景天苷是一种源自植物的苯丙素类糖苷，具有抗疲劳、抗衰老、抗癌、抗氧化、抗炎等多种生物活性，在食品、营养品、化妆品及药品中应用广泛，市场需求不断增长。目前工业上主要依赖从红景天属植物中提取，但该方法受限于植物生长缓慢、条件苛刻、红景天苷含量极低，难以满足市场需求。化学合成法则存在纯化困难、产生有毒废弃物等问题。因此，利用微生物发酵进行从头生物合成，成为一种可持续且环境友好的替代生产路线。尽管先前已有研究在工程化大肠杆菌或酿酒酵母中实现了红景天苷的合成，但其产量、生产效率或培养系统复杂性仍不足以支撑工业化生产。针对这些挑战，本研究旨在构建一株高效的大肠杆菌工程菌株，通过系统性代谢工程策略，实现红景天苷的高产量、高生产率从头合成，并为其他酪醇衍生物的高效生物合成提供重要指导。

研究的详细工作流程可分为五个主要阶段，环环相扣，层层递进。

第一阶段是构建高效的酪醇（Tyrosol）从头合成途径。红景天苷由前体酪醇与尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-glucose, UDPG）缩合而成，因此充足的酪醇供应是前提。研究以大肠杆菌BL21(DE3)为底盘菌株，首先通过引入酿酒酵母来源的苯丙氨酸脱羧酶基因 aro10 和乙醇脱氢酶基因 *adh6*，构建了能够从葡萄糖从头合成酪醇的基础菌株LC1，其酪醇产量为26.78 mg/L。随后，研究进行了系统性的代谢工程改造以提升酪醇积累：1）敲除 tyrR 基因，以解除芳香族氨基酸合成途径的阻遏调控；2）过表达反馈抑制不敏感型的分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶（*aroGfbr*）和酪氨酸转氨酶（*tyrC*），以增强流向4-羟基苯丙酮酸（4-HPP）的通量；3）敲除磷酸转移酶系统（PTS）基因 ptsG 和 *crr*，以减轻葡萄糖摄取对中心碳代谢的负担；4）敲除竞争途径基因 pheA 和 *trpE*，以减少前体流向苯丙氨酸和色氨酸的分流。经过这一系列改造，得到了菌株LC7，其在摇瓶发酵72小时后，酪醇产量达到3.0 g/L。然而，研究观察到高浓度酪醇的积累显著抑制了细胞生长（OD600降低），这成为限制产量进一步提升的瓶颈。

第二阶段是通过适应性进化（Adaptive Evolution）提升工程菌株的酪醇耐受性。为了缓解酪醇对细胞生长的抑制，研究对敲除了多个基因的底盘菌株（E. coli BL21(DE3)-ΔtyrRΔptsGΔcrrΔpheAΔtrpE）采用了常压室温等离子体（Atmospheric pressure room temperature plasma, ARTP）诱变与适应性进化相结合的策略。首先确定了ARTP处理60秒（致死率98%）为最佳诱变条件。随后，利用自动高通量微生物液滴培养仪（MMC），在酪醇浓度逐步增加的压力下（从0 g/L至最终4.0 g/L）对诱变后的菌群进行连续传代适应性培养。进化结束后，筛选出7株进化菌株，并通过重新导入携带 aro10-adh6 和 aroGfbr-tyrC 的质粒，构建了对应的工程菌株LC8-LC14。摇瓶发酵测试表明，其中6株的酪醇产量超过LC7，表现最好的LC10产量达到3.3 g/L。更重要的是，在含有3.0 g/L酪醇的培养基中，进化菌株LC10的生长（OD600）比对照菌株LC7提高了10%，证明其酪醇耐受性得到了有效增强。

第三阶段是实现红景天苷的从头合成。在获得了高产且耐受酪醇的菌株基础上，研究引入了拟南芥来源的糖基转移酶AtUGT85A1，以及大肠杆菌内源的磷酸葡萄糖变位酶（Phosphoglucose mutase, PGM）和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase, GalU），以催化酪醇与UDPG生成红景天苷。将相关质粒分别转入原始底盘菌株和进化菌株LCE03，得到菌株W0和W1。摇瓶发酵72小时后，W0和W1分别产生了0.2 g/L和0.4 g/L的红景天苷，但分别有超过2.8 g/L的酪醇未被糖基化，表明糖基化步骤是瓶颈。为了增加UDPG的供应，研究在W1的基础上过表达了 pgm 和 galu 基因，构建了菌株W2。W2的红景天苷产量显著提升至4.7 g/L，然而仍有2.4 g/L酪醇残留，说明糖基化效率仍需进一步提高。

第四阶段是糖基转移酶AtUGT85A1的半理性设计（Semirational Design）。为了突破糖基化效率的限制，研究对AtUGT85A1进行了蛋白质工程改造。首先基于AlphaFold 2数据库预测了AtUGT85A1的三级结构，并使用Discovery Studio软件对酶与底物UDPG和酪醇进行了分子对接（Molecular Docking）分析。通过丙氨酸扫描（Alanine Scanning）和对接相互作用分析，选定了活性中心附近5 Å内的9个氨基酸位点（Q406, Y157, N234, D126, A21, I25, H24, T148, W384）进行定点突变。构建了9个突变体（W3-W11），并进行了摇瓶发酵筛选。结果表明，突变体W7（A21G）效果最显著，其红景天苷产量达到7.5 g/L，比野生型（W2）提高了31.2%，同时酪醇积累量显著下降。对A21位点进行NNK饱和突变未发现更优突变体。进一步的模型分析显示，将第21位的丙氨酸（Alanine）突变为甘氨酸（Glycine）后，活性位点附近一段无规则卷曲的灵活性增加，减少了底物进入活性位点口袋的空间位阻，从而提高了催化效率。而D126A和H24A突变则严重降低了酶活，证实这两个氨基酸是关键的活性位点残基。

第五阶段是5升生物反应器规模的补料分批发酵（Fed-batch Fermentation）优化。为了评估最优工程菌株的工业化潜力，研究将发酵规模放大至5升生物反应器。首先，为了解决前期敲除 trpE 导致的营养缺陷和生长不良问题，研究通过在W2和W7菌株中原位恢复 trpE 基因的表达（将起始密码子ATG改为GTG），构建了菌株W12（表达野生型UGT85A1）和W13（表达突变体UGT85A1A21G），成功恢复了细胞生长。在30%溶解氧（DO）条件下，W12和W13分别产生4.5 g/L和11.8 g/L红景天苷，残留酪醇分别为13.4 g/L和7.0 g/L，再次验证了A21G突变体的优越性。但过量的酪醇积累仍抑制生长。为进一步提升W13的产量，研究将发酵过程中的溶解氧水平从30%提高至40%。这一优化使得细胞生长和葡萄糖消耗均提升了约40%，最终在发酵46小时时，红景天苷产量达到16.8 g/L，生产率（Productivity）为0.4 g/(L·h)，这是目前在大肠杆菌中报道的最高产量水平。

本研究获得的主要结果数据支撑充分，逻辑链条清晰。从LC7的3.0 g/L酪醇，到LC10进化后的3.3 g/L且耐受性提升，标志着前体供应和细胞工厂鲁棒性问题得到初步解决。从W1的0.4 g/L红景天苷，到过表达UDPG供应途径后W2的4.7 g/L，明确了UDPG供应是关键限制因素之一。从W2的4.7 g/L到酶突变体W7在摇瓶中的7.5 g/L，证明了通过蛋白质工程提高糖基转移酶效率的有效性。最终，在5L发酵罐中，通过修复营养缺陷和优化溶氧，工程菌株W13实现了16.8 g/L的最终产量和0.4 g/(L·h)的高生产率。每一步的结果都为下一步的工程策略提供了明确的依据和方向，最终汇聚成高效的生物合成路线。

研究的结论是，通过系统性代谢工程、适应性进化、关键酶半理性设计及发酵工艺优化相结合的策略，成功构建了一株能够高效从头合成红景天苷的大肠杆菌工程菌株。该菌株在5升生物反应器中达到了16.8 g/L的产量和0.4 g/(L·h)的生产率，为红景天苷的未来工业化生产奠定了坚实的基础。此外，研究所发展的综合策略（包括增强前体供应、提升宿主耐受性、优化辅因子供应、改造关键酶等）也为其他酪醇衍生物乃至更广泛的植物天然产物的高效微生物合成提供了重要的方法论指导和应用借鉴。

本研究的亮点突出体现在以下几个方面：首先，在产量和生产效率上取得了显著突破，实现了目前大肠杆菌合成红景天苷的最高产量，且发酵时间相对较短，更具工业应用潜力。其次，研究采用了多策略融合的系统性工程方法，从途径构建、宿主耐受性进化、辅因子工程到酶分子改造，形成了完整且高效的“设计-构建-测试-学习”（DBTL）循环。第三，创新性地将ARTP诱变与自动化高通量适应性进化（MMC）相结合，快速获得了耐受高浓度产物的进化菌株，该方法高效且具有普适性。第四，在没有晶体结构的情况下，成功利用AlphaFold2预测结构进行分子对接和半理性设计，获得了性能提升31.2%的糖基转移酶突变体（A21G），展示了计算生物学辅助酶工程的有力应用。最后，研究不仅关注摇瓶水平的产量，还深入进行了规模放大和发酵工艺优化（如溶氧控制），使研究成果更贴近实际生产考量。

此外，研究也坦诚地指出了当前工作的局限性与未来方向：尽管产量显著，但发酵末期仍有大量酪醇残留，表明糖基化效率仍是最终限制步骤；红景天苷在发酵后期产量有所下降，提示可能存在内源性糖苷水解酶（Glycoside Hydrolase）的降解作用；发酵罐与摇瓶的生产效率仍存在差距，提示还有通过pH控制、补料模式等进一步工艺优化的空间。这些分析为后续研究指明了清晰的改进目标，例如通过解析AtUGT85A1的晶体结构进行更精准的理性设计、挖掘更多高效的天然糖基转移酶、鉴定并敲除可能的糖苷水解酶基因等。